一种具有酪氨酸交联活性的小麦种子过氧化物酶的分离纯化及性质研究

论文摘要

小麦的加工品质与小麦中各种蛋白含量和组成密切相关。小麦高分子量麦谷蛋白（HMW-GS）、低分子量麦谷蛋白（LMW-GS）和醇溶蛋白（gliadins）交联形成了面筋三维蛋白网络骨架,它直接决定了小麦的加工品质。阐明面筋蛋白的交联机制对小麦加工品质改良有重要意义。2001年,Tilley等人[30]提出了面筋酪氨酸交联理论,该理论对经典的面筋蛋白二硫键交联假说提出了挑战。研究结果显示,酪氨酸交联的形成许多都是由过氧化物酶或具有过氧化物酶性质的酶所催化的。本研究从小麦种子中分离纯化出一种小麦过氧化物酶（WsPOD）,对WsPOD的理化性质、光谱特性进行了研究;通过生物质谱技术（MALDI-TOF）对WsPOD肽指纹图谱作了初步分析;酪氨酸催化实验表明WsPOD具有酪氨酸交联活性;WsPOD的微量掺粉实验表明WsPOD能提高面团的流变学特性。本研究旨在阐明面筋蛋白酪氨酸交联的催化机理,支持和完善面筋交联的新理论,以期建立小麦品质改良的新策略,为食品工业大量使用的化学添加剂找到安全的替代品。1. WsPOD的分离纯化。关于过氧化物酶的分离纯化已有较多报道,但小麦中过氧化物酶分离纯化的报道很少,国内尚未见报道。本实验建立了从小麦种子中分离过氧化物酶WsPOD的高效简捷的分离方法;经乙酸酸沉淀、硫酸铵分级沉淀、FPLC-Source 30S离子交换柱层析,FPLC-Superdex G-75凝胶过滤柱层析从小麦种子中分离得到了电泳纯的WsPOD。SDS-PAGE结果显示为单一条带;SDS-PAGE显示表观分子量约为36KD左右。2. WsPOD的理化性质。以愈创木酚为底物,对WsPOD催化反应最适pH值、最适过氧化氢浓度、最适温度、热稳定性;光谱特性等理化性质进行了测定,结果表明WsPOD催化反应最适pH值在5.0左右,最适反应温度为40℃,最适过氧化氢浓度为14mmol/L,;紫外可见光谱扫描分析显示该酶为含血红素辅基的酸性蛋白,在399nm处有一典型的Soret带吸收;热稳定性实验表明WsPOD具有较好的耐热性。3. WsPOD肽指纹图谱分析。分离得到的WsPOD应用基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）进行肽指纹图谱分析,发现在现有的蛋白质数据库中仅有一个结果与WsPOD肽指纹相匹配。对获得数据信息进行分析显示WsPOD为胚乳特异性表达的一种过氧化酶,保守性分析表明该酶具有两个保守性区域分别为过氧化物酶催化活性位点和血红素辅基近端结合位点。WsPOD的肽质量指纹数据得到的序列信息,为WsPOD的cDNA克隆奠定了良好的基础。4. WsPOD的酪氨酸交联活性测定。将WsPOD催化单体酪氨酸反应后的产物经UV1100型紫外可见分光光度计扫描分析和高效液相色谱质谱联用仪（HPLC-ESI/MS）分析,结果显示WsPOD能催化单体酪氨酸形成双体酪氨酸,具有酪氨酸交联活性。5. WsPOD的微量掺粉实验。以洛阳8716作为参比基础面粉,采用50克面粉体系参照国家标准GB/T 14614-93方法进行微量掺粉实验,结果表明WsPOD能延长面团形成时间和稳定时间,提高面粉的质量指数,使面团具有更好的粘、弹性及更强的耐揉性。6.双体酪氨酸标准物的化学合成。参照Michael Tilley等人的方法,通过化学合成的方式获得了双体酪氨酸混合物,经HPLC-C18Revered phase column分离纯化得到了双体酪氨酸纯品,为后续实验提供内参标准物。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 文献综述
• 第一章 小麦面筋蛋白与小麦品质的关系
• 1.1 小麦面筋蛋白的组成
• 1.2 麦谷蛋白与小麦品质的关系
• 1.3 麦醇溶蛋白与小麦品质的关系
• 1.4 麦谷蛋白大聚合体与小麦品质的关系研究
• 第二章 小麦面筋交联理论的研究现状
• 2.1 面筋蛋白聚合体形成的机理
• 2.1.1 二硫键理论
• 2.1.2 酪氨酸交联理论
• 2.2 催化酪氨酸交联的酶学机理研究进展
• 2.3 面粉中存在酪氨酸交联酶的证据
• 第三章 过氧化物酶的研究概况与进展
• 3.1 过氧化酶简介
• 3.2 POD 的分子结构及组成
• 3.2.1 POD 的分子结构特点
• 3.2.2 POD 序列上的保守性
• 3.3 过氧化物酶的催化反应机理
• 3.3.1 HRP 的催化机理
• 3.3.2 哺乳动物过氧化物酶（Mammalian peroxidase） 的催化机理
• 3.4 POD 的生理作用及其相关的分子生物学研究
• 3.4.1 木质化、木栓化和其它细胞壁代谢的研究
• 3.4.2 生长素代谢的研究
• 3.4.3 创伤和病原体侵染
• 3.4.4 褐变
• 3.4.5 POD 与PPO 的关系
• 3.5 POD 与酪氨酸交联的研究
• 第四章 研究的目的及意义
• 实验部分
• 第一章 具有酪氨酸交联活性小麦种子过氧化物酶（WSPOD）的分离纯化及鉴定
• 1.1 主要仪器和试剂
• 1.1.1 植物材料
• 1.1.2 柱材料
• 1.1.3 主要试剂及其配制
• 1.1.4 主要仪器
• 1.2 实验方法
• 1.2.1 供试小麦种子过氧化物酶（WsPOD）的色谱分离样品的制备
• 1.2.2 样品及缓冲体系的准备
• 1.2.3 Source30s 离子交换柱和 Superdex G75 凝胶过滤柱的前处理、再生与保存
• 1.2.4 WsPOD 的 FPLC--Source30s 离子交换柱层析
• 1.2.5 WsPOD 的FPLC—Superdex G75 凝胶过滤柱层析
• 1.2.6 WsPOD 的电泳分析
• 1.2.7 WsPOD 的肽指纹图谱（MALDI-TOF）测序
• 1.3 结果与分析
• 1.3.1 FPLC--Source30s 离子交换柱层析
• 1.3.2 FPLC—Superdex G75 凝胶过滤柱层析
• 1.3.3 WsPOD 的纯化和纯度鉴定
• 1.3.4 WsPOD 的肽指纹图谱（MALDI-TOF）分析
• 1.3.5 WsPOD 的氨基酸序列及同源性分析
• 1.4 讨论
• 1.4.1 WsPOD 的提取
• 1.4.2 WsPOD 的分离纯化
• 1.4.3 WsPOD 的肽指纹图谱分析
• 第二章 WsPOD 的酶学性质研究
• 2.1 主要仪器和试剂
• 2.1.1 主要试剂
• 2.1.2 仪器
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 蛋白质含量测定
• 2.2.2 WsPOD 的小麦种子过氧化物酶活性测定
• 2.2.2.1 WsPOD 反应最适pH
• 2.2.2.2 WsPOD 反应最适H202 浓度
• 2.2.2.3 WsPOD 的反应最适温度
• 2.2.2.4 WsPOD 的热稳定性
• 2.2.3 WsPOD 的酪氨酸交联活性测定
• 2.2.4 双体酪氨酸的化学合成及制备
• 2.2.5 WsPOD 的紫外可见吸收光谱的测定
• 2.2.6 氧化还原剂对WsPOD 的紫外可见吸收光谱影响的测定
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 WsPOD 反应最适pH
• 2.3.2 WsPOD 反应最适H202 浓度
• 2.3.3 最适反应温度及热稳定性
• 2.3.4 WsPOD 的酪氨酸交联活性
• 2.3.5 双体酪氨酸的化学合成及制备
• 2.3.6 WsPOD 的紫外可见吸收光谱的测定
• 2.3.7 氧化还原剂对WsPOD 的紫外可见吸收光谱的影响
• 2.4 讨论
• 2.4.1 WsPOD 的热稳定性
• 2.4.2 WsPOD 的酪氨酸交联活性
• 第三章 WsPOD 对面粉加工性能的影响
• 3.1 主要仪器和试剂
• 3.1.1 主要试剂
• 3.1.2 主要使用仪器
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 小麦种子过氧化物酶的掺粉品质效应测定
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 小麦种子过氧化物酶的掺粉品质效应
• 3.4 讨论
• 3.4.1 WsPOD 对小麦粉的品质效应
• 参考文献
• 致谢
• 作者简介