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小麦纹枯病菌胞壁降解酶的致病作用及PG的分离纯化与理化特性

2020-12-12阅读(783)

小麦纹枯病菌胞壁降解酶的致病作用及PG的分离纯化与理化特性

论文摘要

纹枯病（Rhizoctonia cerealis）是导致我国乃至世界小麦减产的重要病害。为了深入阐明小麦纹枯病菌的致病机理,特别是多聚半乳糖醛酸酶（PG）等胞壁降解酶在致病过程中的作用,为病害防治提供新的理论依据及有效手段,本文对病菌产生的胞壁降解酶种类及其致病作用进行了初步研究,同时首次分离、纯化出病菌的一种PG,并明确其组成和理化性质。试验结果如下：将病菌菌丝块移至改良的Marcus培养液中22℃下培养6d,经抽滤除去菌丝,和离心（4℃、8000rpm,10min）去除沉淀,获上清即粗酶液。通过测定,病菌能产生多聚半乳糖醛酸酶（PG）、果胶甲基半乳糖醛酸酶（PMG）、纤维素酶（Cx）、多聚半乳糖醛酸转移消除酶（PGTE）和果胶甲基转移消除酶（PMTE）等5种胞壁降解酶,其中,PG活性最高,酶活达722.22U/mL；其次是PMG和Cx,酶活分别为444.44U/mL和245.79U/mL；而PGTE和PMTE活性很低。另外,在小麦叶鞘病斑组织中,PG、PMG和Cx三种酶的活性均极显著高于PGTE和PMTE；不同病斑部位中,褪绿部（病斑最外侧）酶活最高；其次是褐色部；而枯白部（病斑中央）酶活较低。这表明在病菌侵染和破坏寄主植物的初期,PG、PMG和Cx等胞壁降解酶发挥着重要作用。针刺接种表明,病菌PG、Cx及其混合酶液（1：1）可破坏小麦叶鞘组织,引起一定病状,如黄化,出现水渍状病斑。另外,PG、Cx及其混合酶液对小麦叶鞘细胞膜有显著的损伤作用,即改变细胞膜透性,导致还原糖量增高。通过丙酮沉淀和离心（4℃、8000r/min,15min）,从病菌培养滤液中提取PG粗蛋白。将PG粗蛋白依次经DEAE Sepharose Fast Flow离子交换层析Phenyl-Sepharose6Fast Flow疏水层析和Sephadex G-75凝胶过滤层析,获得具有较高活性的PG纯化蛋白。SDS-PAGE和IEF-PAGE电泳表明,PG蛋白分子量为41.78kD,等电点为5.34。经初步组成分析,PG含有糖基,含糖量为9.1%,不含脂类物质,是一种糖蛋白；其蛋白部分含有α-氨基酸,不含芳香族氨基酸。另外,PG在pH4-12范围内均有活性,pH6时活性最大；对高温（≥40℃）不稳定,100℃水浴20min活性完全丧失；对紫外线、氯仿、胰蛋白酶和蛋白酶K都非常敏感,处理后活性分别下降81.4%、85.1%、84.3%和89.8%。

论文目录

  • 摘要
  • Abstract
  • 引言
  • 1 小麦纹枯病发生与危害
  • 1.1 症状
  • 1.2 危害
  • 1.3 病菌
  • 2 植物病原真菌重要致病因子
  • 2.1 酶
  • 2.1.1 角质酶
  • 2.1.2 胞壁降解酶
  • 2.1.2.1 果胶酶
  • 2.1.2.2 纤维素酶
  • 2.1.2.3 半纤维素酶
  • 2.1.2.4 其他酶
  • 2.2 毒素
  • 2.2.1 寄主专化性毒素
  • 2.2.2 非寄主专化性毒素
  • 3 植物病原真菌多聚半乳糖醛酸酶（PG）
  • 3.1 PG的分离纯化
  • 3.2 PG的活力检测
  • 3.3 PG的理化特性
  • 3.4 PG的致病作用
  • 3.5 PG的基因克隆与表达
  • 4 丝核菌PG及其基因研究
  • 5 本论文研究的目的和意义
  • 材料与方法
  • 1 供试菌株
  • 2 培养基
  • 3 试剂和仪器
  • 3.1 主要试剂
  • 3.2 主要仪器
  • 4 胞壁降解酶产生与活性的测定
  • 4.1 病菌培养
  • 4.2 粗酶提取
  • 4.3 酶活测定
  • 4.3.1 所需溶液的配制
  • 4.3.2 Cx活性测定
  • 4.3.3 PG和PMG活性测定
  • 4.3.4 PGTE和PMTE活性测定
  • 5 胞壁降解酶致病作用的测定
  • 5.1 胞壁降解酶对小麦叶銷破坏作用的测定
  • 5.2 胞壁降解酶对小麦叶銷细胞膜损伤的测定
  • 5.3 不同病斑部位胞壁降解酶活性的测定
  • 6 PG的提取与纯化
  • 6.1 粗酶的提取
  • 6.2 DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换层析
  • 6.3 Phenyl-Sepharose 6 Fast Flow 疏水柱层析
  • 6.4 Sephadex G-75凝胶过滤柱层析
  • 7 PG的组成分析
  • 7.1 双缩脲反应
  • 7.2 油红-O染色反应
  • 7.3 蒽酮反应
  • 7.4 茚三酮反应
  • 7.5 浓硝酸反应
  • 7.6 含糖量测定
  • 8 PG理化性质的测定
  • 8.1 分子量测定
  • 8.1.1 溶液配制
  • 8.1.2 玻板处理和安装
  • 8.1.3 凝胶配制
  • 8.1.4 胶板灌制
  • 8.1.5 加样
  • 8.1.6 电泳条件
  • 8.1.7 胶板剥离
  • 8.1.8 染色与脱色
  • 8.1.9 分子量计算
  • 8.2 等电点测定
  • 8.2.1 溶液配制
  • 8.2.2 电极缓冲液配制
  • 8.2.3 凝胶配制及加样
  • 8.2.4 灌胶
  • 8.2.5 电泳
  • 8.2.6 剥胶
  • 8.2.7 固定
  • 8.2.8 胶条长度测定
  • 8.2.9 pH标准曲线制作
  • 8.2.10 pI计算
  • 8.3 稳定性测定
  • 8.3.1 对热稳定性测定
  • 8.3.2 对酸碱稳定性测定
  • 8.3.3 对紫外线稳定性测定
  • 8.3.4 对氯仿稳定性测定
  • 8.3.5 对蛋白酶稳定性测定
  • 结果与分析
  • 1 小麦纹枯病菌胞壁降解酶的种类及其活性
  • 1.1 Cx活性
  • 1.2 PG和PMG活性
  • 1.3 PGTE和PMTE活性
  • 2 小麦纹枯病菌胞壁降解酶的致病作用
  • 2.1 胞壁降解酶对小麦叶鞘组织的破坏
  • 2.2 胞壁降解酶对小麦叶鞘细胞膜的损伤
  • 2.3 不同病斑部位胞壁降解酶活性的比较
  • 3 小麦纹枯病菌PG的提取与纯化
  • 3.1 PG粗蛋白的提取
  • 3.2 PG蛋白的纯化
  • 3.2.1 DEAE Sepharose Fast Flow离子交换层析
  • 3.2.2 Phenyl-Sepharose 6 Fast Flow疏水层析
  • 3.2.3 Sephadex G-75凝胶过滤层析
  • 4 小麦纹枯病菌PG的组成分析
  • 4.1 含肽键
  • 4.2 不含脂
  • 4.3 含糖基及含糖量
  • 4.4 含α-氨基
  • 4.5 不含芳香族氨基酸
  • 5 小麦纹枯病菌PG的理化性质
  • 5.1 PG分子量
  • 5.2 PG等电点
  • 5.3 PG稳定性
  • 5.3.1 对热稳定性
  • 5.3.2 对酸碱稳定性
  • 5.3.3 对紫外线稳定性
  • 5.3.4 对氯仿稳定性
  • 5.3.5 对蛋白酶稳定性
  • 讨论
  • 1 小麦纹枯病菌胞壁降解酶种类与致病作用
  • 2 小麦纹枯病菌PG的提取与纯化
  • 3 小麦纹枯病菌PG的组成与理化特性
  • 4 小麦纹枯病菌PG的分子生物学研究
  • 参考文献
  • 附录
  • 致谢

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