白桦花期抑制性消减文库的构建及花发育相关基因的克隆

论文摘要

白桦（Betula platyphylla）为我国东北与内蒙古地区的先锋树种,广泛用于建筑、家俱和造纸业。为缩短白桦育种周期,加速其育种进程,近些年来人们在白桦早花诱导方面取得了巨大成功。然而白桦花期基因表达背景却鲜为人知,直到最近几年,若干花发育相关基因在欧洲白桦中才得以成功克隆。为进一步充实本领域研究,继本实验室白桦生殖生物学雄厚的研究基础,本文从事了以下工作。 对白桦花序进行分期取材,基于SMART（Switching Mechanism At 5’end of RNATranscript）策略,利用PCR—SelectTM cDNA Subtraction Kit分别构建白桦雌雄花序抑制性消减文库。经多重比对分析,计算文库冗余度,雌花正向库为12.14%,雌花反向库为15.48%,雄花正向库为29.30%,雄花反向库为27.85%。去除重复EST后,设定期望阈值为e-10,经blastX分析,去除rDNA污染和镶嵌克隆,雌花正向库,共容纳EST数为65条:雌花反向库中为71条:雄花正向库中为68条;雄花反向库中为65条。进一步合并后,雌花消减库共获得126条EST,雄花消减库共获得115条EST。文库中存在一些同类EST,分析表明,它们对应着同一基因的不同片段,或是代表同一基因家族的不同成员。雌、雄花消减库比较表明,两者少有冗余现象。按GO分类系统,消减库中EST参与新陈代谢、细胞生长与分裂、细胞结构组成、跨膜运输、信号传递、胁迫应答、转录调控、翻译、蛋白降解等生命过程。由于文库构建是以总RNA为起始材料,测序结果中有一定程度的rDNA污染。Blast比对结果表明,文库中容纳了一些明显同花发育相关的EST,它们将成为进一步研究白桦花发育问题的物质基础。 根据公共数据库中欧洲白桦已发表序列,通过RT-PCR手段,克隆了四个花发育相关基因BpMADS1、3、5及BpSPL1,序列分析表明两种白桦在核酸及蛋白序列上存在一定差异,其中三个基因的EST未出现在消减文库中,对此种现象出现的原因作了推测;以消减文库中的两条EST为材料,通过RACE手段克隆了两个新的花发育相关基因—BPSPL2和BPAGL2,使用TreeTOP工具对其系统发生位置进行了初步评价。 以消减文库中的四个花发育相关基因的EST为材料,建立了外标实时定量PCR体系。研究结果表明,几个目标基因均呈现时序表达特点,根据目的基因的表达模式对其可能参与的功能作了初步分析。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 绪论
• 1.1 花发育分子遗传学的研究进展
• 1.1.1 花发育分子遗传学的兴起
• 1.1.2 建立在模式植物基础上的花发育分子遗传学
• 1.1.3 花发育相关基因的分化
• 1.2 基因克隆的快捷策略
• 1.2.1 同系位候选法
• 1.2.2 全长cDNA文库构建
• 1.2.3 差接式快捷基因克隆法
• 1.2.4 RACE
• 1.3 白桦生殖生物学的研究
• 1.4 本研究的目的意义
• 2 白桦花期抑制性消减文库的构建及EST分析
• 2.1 实验材料、试剂和设备
• 2.1.1 实验材料
• 2.1.2 酶及化学试剂
• 2.1.3 主要仪器设备
• 2.2 方法
• 2.2.1 白桦花序总RNA的提取
• 2.2.2 反转录
• 2.2.3 cDNA扩增
• 2.2.4 Rsa Ⅰ酶切
• 2.2.5 Tester cDNA加接头
• 2.2.6 抑制性消减杂交
• 2.2.7 抑制性消减文库的建立
• 2.2.8 重组体插入片段长度的PCR检测
• 2.2.9 测序模板制备
• 2.2.10 测序反应
• 2.2.11 EST处理及冗余度计算
• 2.3 实验结果和分析
• 2.3.1 白桦总RNA的提取
• 2.3.2 白桦cDNA的扩增
• 2.3.3 白桦cDNA的酶切
• 2.3.4 接头连接检测
• 2.3.5 抑制性消减杂交产物的PCR检测
• 2.3.6 插入片段检测
• 2.3.7 EST处理及文库分析
• 2.4 讨论
• 2.4.1 影响文库质量的因素
• 2.4.2 花发育相关EST
• 2.5 本章小结
• 3 花发育相关基因的克隆
• 3.1 方法
• 3.1.1 RT-PCR法克隆白桦花发育相关基因
• 3.1.2 RACE策略克隆花发育相关基因
• 3.2 实验结果
• 3.2.1 RT-PCR结果
• 3.2.2 RT-PCR候选基因序列分析
• 3.2.3 RACE操作cDNA编码区全长的获得
• 3.2.4 RACE操作候选基因序列分析
• 3.2.5 其它基因序列分析
• 3.3 讨论
• 3.4 本章小结
• 4 花发育相关基因的时序表达分析
• 4.1 材料介绍
• 4.2 方法
• 4.2.1 总RNA提取
• 4.2.2 cDNA第一链合成
• 4.2.3 标准样制备
• 4.2.4 实时定量PCR
• 4.3 结果和分析
• 4.3.1 RNA提取
• 4.3.2 标准样检测
• 4.3.3 实时定量标准曲线
• 4.3.4 目标基因表达丰度曲线
• 4.4 讨论
• 4.4.1 外标定量在本实验中的应用
• 4.4.2 目标基因的表达分析
• 4.4.3 文库构建中的假阳性问题的体现
• 4.5 本章小结
• 结论
• 参考文献
• 附录A
• 附录B
• 附录C
• 攻读学位期间发表的学术论文
• 致谢