miRNA干扰降低信号调节蛋白α表达提高DC疫苗抗肿瘤活性及其单克隆抗体的制备和应用

论文摘要

一、miRNA干扰降低信号调节蛋白α表达提高DC疫苗抗肿瘤活性研究背景和目的信号调节蛋白a （SIRPα）是SIRP家族中最主要的成员。SIRPα的组织分布主要在髓系（巨噬细胞,树突状细胞等）,因此SIRPa在机体免疫调节中的作用已被日益重视。总的来说,在免疫系统中SIRPα通过与特异性配体CD47相互作用发挥负向调节作用。在天然免疫中,LPS可通过转录抑制和蛋白降解途径诱导巨噬细胞中SIRPa表达下调,SIRPa通过屏蔽SHP-2作用抑制MAPK、IKKs、NF-κB和IRF3激活,减少炎性因子IL-6、TNFα和IFNβ释放。但用SIRPα抗体与SIRPα结合,能促进巨噬细胞分泌一氧化氮,这从另一方面说明了SIRPα有可能在天然免疫中起到一定的正向调节作用。在SIRPα与获得性免疫关系的研究中,利用CD47-Fc段融合蛋白作为配体与DC表面SIRPα相互作用,能观察到DC表型和功能的抑制,包括DC成熟标志减少,细胞因子IL-12分泌减少。DC表面的SIRPα与T细胞表面的CD47相互结合,双向负调节DC和T细胞功能：一方面,抑制DC活化,下调其抗原递呈能力；另一方面,抑制T细胞增殖和杀伤功能。由于实验方法的限制,目前对于SIRPα在获得性免疫DC中的功能和应用研究相对较少,缺乏系统性。在肿瘤免疫中,获得性免疫激活起着不可或缺的作用,而树突状细胞（dendritic cell, DC）是目前发现的功能最强的专职性抗原递呈细胞（antigen-presenting cells, apc）,能摄取和加工递呈抗原,具有强大的激活CD8+、CTL及CD4+T辅助细胞的能力,控制着体内获得性免疫反应的过程,在免疫应答中处于中心地位,因而成为肿瘤免疫反应的中心环节。DC可以在体外培养后用于体内免疫治疗,也可通过骨髓造血干细胞移植,并辅以细胞因子或其它因子如flt-3等在体内扩增。用DC疫苗进行肿瘤免疫治疗已受到重视,且成为当今生物治疗领域倍受关注的热点课题。利用慢病毒向树突状细胞导入SIRPα的干扰片断,有助于全面了解SIRPα在获得性免疫中功能,为SIRPα在获得性免疫中的应用打下坚实的基础。实验方法1.构建慢病毒质粒：LV-microRNA-SIRPα、LV-GFP、LV-SIRPα;慢病毒包装和滴度检测；2.骨髓来源DC的分离培养；3. SIRPα对DC活化的影响及机制：a)生存能力的改变：（a）PI染色流式细胞计数在无GM-CSF的培养条件下各组DC的生存能力；（b）免疫蛋白共沉淀实验验证：P85与SIRPα相互结合；（c）生存能力相关PI3K-AKT通路的改变—Western-blot; （e）抑制剂抑制PI3K-AKT通路后,观察计数在无GM-CSF的培养条件下各组DC的生存能力；（d）检测P13K磷酸化情况,观察SIRPα对其影响；’（f）构建磷酸化位点突变AKT,观察其对无GM-CSF的培养条件下各组DC的生存能力的影响。b)成熟和迁移能力的改变：（a）PE标记的MHCⅡ、CD80、CD86、CCR7、CCR5流式细胞计数；（b）分泌细胞因子功能的改变—IL12、IL-6、TNFαELISA检测；（c）体内观察干扰SIRPα的DC迁移和增殖能力的改变—CFSE标记,流式检测代谢；（d）免疫蛋白共沉淀实验验证：SHP2与SIRPa相互结合；（e）慢病毒介导的SHP2干扰和SHP2-SIRPa双干扰DC,鉴定IL12、CD80、CD86、CCR7、CCR5的改变,确认成熟和迁移能力是否与SHP2相关；（f）分泌功能相关JAK-STAT通路的改变—Western-blot;（g）成熟迁移相关NF-KB通路的改变—Western-blot。c)对T细胞的抗原递呈能力：（a）T细胞的增殖能力的改变—H3增殖实验；（b）T细胞分泌IFN-γ水平的改变—ELISPOT检测；（c）T细胞杀伤功能的改变—非放射性乳酸脱氢酶检测。4.体内观察干扰SIRPα的DC的肿瘤免疫功能的改变—在治疗和预防模型中应用SIRPα干扰的DC疫苗,观察对肿瘤大小和小鼠生存时间的影响。实验结果1.LPS诱导DC活化过程中,SIRPα表达下调,细胞生存相关的AKT磷酸化水平升高、Bcl-2表达增高；SIRPα-silened DC无GM-CSF条件下培养12hr后,抗凋亡能力显著强于对照组；免疫蛋白共沉淀实验验证：P85与SIRPα相互结合；抑制剂抑制PI3K-AKT通路后,在无GM-CSF的培养条件下DC凋亡和死亡增加；磷酸化位点突变AKT和SIRPα过表达腺病毒感染DC后,在无GM-CSF的培养条件下DC凋亡和死亡增加；2. SIRPα-silenced DC成熟表型:MHCⅡ、CD80和CD86表达增强,迁移相关表型CCR7表达增强、CCR5表达降低；免疫蛋白共沉淀实验验证：SHP2与SIRPa相互结合；3. SIRPα-silenced DC分泌细胞因子IL-12增强；4. SIRPα-silenced DC体外刺激T细胞增殖能力增强；5. SIRPα-silenced DC体内刺激T细胞分泌IFNγ能力增强；6.降低SIRPα表达的DC免疫naive C57小鼠,对免疫原性强的5x105 EG7细胞皮下种植有100%免疫预防能力,肿瘤注射两周后能观察的小鼠脾CD8+T分泌IFNγ能力增强。降低SIRPα表达的DC免疫naive C57小鼠,对免疫原性弱的1×105 B16F10皮下种植有>50%免疫预防能力；7.降低SIRPα表达的DC免疫荷瘤小鼠,能有效治疗EG7和B16肿瘤。结论本实验通过慢病毒干扰技术有效抑制DC中SIRPα的表达,并通过体内体外实验证实SIRPα在DC生存、成熟和抗原递呈中起着重要的抑制作用。此外,我们还通过小鼠肿瘤模型进一步证实SIRPα在肿瘤免疫中发挥抑制性调节作用。结果提示：干扰DC中SIRPα制备的DC疫苗有可能成为肿瘤免疫治疗中重要的组成部分。二、人信号调节蛋白α单克隆抗体的制备和应用研究背景和目的：信号调节蛋白（signal regulatory proteins, SIRPs）家族是属于免疫球蛋白超家族的成员（IgSF）。第一个被明确的SIRP家族成员既是大鼠的蛋白酪氨酸磷酸酶SIRPa,也叫SHPS1, CD172a, P84等,是一种主要表达于髓系细胞（巨噬细胞,树突状细胞等）的膜蛋白。SIRPa在细胞内传递信号主要通过胞内酪氨酸残基的磷酸化。其胞外区的三个Ig样结构域可被多种有丝分裂原活化而发生胞内区的磷酸化,如血清、胰岛素、生长因子、EGF、PDGF以及神经营养因子等。而整合素介导的细胞与纤粘蛋白和层粘蛋白的粘附也可诱导其磷酸化。丝裂原刺激通过受体型酪氨酸激酶可快速（1-2分钟）磷酸化SIRPa,而粘附介导的磷酸化需经胞浆型酪氨酸激酶的活化发挥作用,通常需要15-20分钟。SIRPa被磷酸化后能结合带有SH2结构域的蛋白磷酸酶SHP-1和SHP-2使之活化,并作为其底物被去磷酸化。近来发现SIRPa还可结合多种接头蛋白如FyB/SLAP 130, SKAP55hom和Grb2,因此被认为是支架蛋白参与多种细胞信号转导途径。SIRPa过去被认为可以负性或正性调节由生长因子或细胞黏附引起的MAPKs激活。此外,表达SIRPa的负显性突变体可以激活NF-κB的活性并使细胞对TNF引起的凋亡耐受。为了进一步明确SIRPa在细胞中负向调控作用,并设计阻断其抑制性信号,提高机体免疫细胞反应性,我们制备并鉴定了人信号调节蛋白a的单克隆抗体（mAb）。SIRPα的胞外区与特异性配体相结合,是其实现信号转导功能的重要途径。目前对SIRPα的特异性配体研究比较多的是另一种膜蛋白CD47。与SIRPa的严格组织细胞表达不同,CD47在大部分细胞类型都有表达,因此SIRPα与CD47复合体在SIRPα介导的信号转导中起着重要作用,包括介导细胞吞噬、迁移和细胞因子分泌等。因此,实验中我们设计合成的多肽针对两者可能的结合位点,利用杂交瘤技术,制备了人SIRPα抗体；通过鉴定其功能,确定此抗体能很好拮抗SIRPα的信号通路,有效提高免疫细胞反应性。实验方法1.制备抗人SIRPa的单克隆抗体：A、合成作为半抗原的多肽,其序列为：RVTTVSESTKRENMDFSISISC;B、将上述多肽与钥孔嘁血蓝蛋白（KLH）偶联,作为免疫原免疫小鼠；C、取免疫鼠的脾细胞,与小鼠骨髓瘤细胞融合；D、经多轮筛选出与合成多肽反应阳性的细胞克隆,作为抗人SIRPa蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株；E、通过在小鼠体内接种杂交瘤细胞生产腹水抗体,将腹水进行纯化,得到抗人SIRPa的单克隆抗体；或者通过体外细胞培养,分离纯化,得到抗人SIRPa的单克隆抗体。2.检测上述抗人SIRPa的单克隆抗体对SIRPa检出能力（通过流式细胞术、免疫组化和Western Blot）。3.检测上述抗人SIRPa的单克隆抗体刺激人巨噬细胞分泌细胞因子能力（抗体芯片和ELISA）。实验结果1.已获可分泌抗SIRPa的杂交瘤细胞；2.分泌的mAb能用于流式细胞术、免疫组化及Western Blot检测,并能刺激经PMA处理的THP-1细胞分泌TNF-a和IL-6等增加。结论利用合成多肽成功制备了特异性好的抗人SIRPa的单克隆抗体,这种抗体能进行流式细胞术、免疫组化及Western Blot检测,并能提高免疫细胞反应性。

论文目录

• 目录
• 中文摘要
• Abstract
• 英文缩略词表
• 第一部分 miRNA干扰降低信号调节蛋白α表达提高DC疫苗抗肿瘤活性
• 引言
• 材料和方法
• 实验结果
• 讨论
• 参考文献
• 小结
• 第二部分 信号调节蛋白α单克隆抗体的制备和应用
• 引言
• 材料和方法
• 实验结果
• 讨论
• 参考文献
• 小结
• 附文献综述
• 参考文献
• 附成果和发表论文
• 致谢