重组人高密度脂蛋白的研究

论文摘要

代谢综合征患者及高脂血症诱发的CAD患者都具有明显的脂类代谢紊乱（胆固醇升高和HDL降低）,通过大量的流行病学研究已经证明血浆HDL水平与CAD呈负相关。动物试验证明,应用血浆HDL可明显预防和改善机体的脂类代谢紊乱,逆转CAD、AS的发生、发展,提示HDL有巨大的临床应用前景。目前,HDL制剂的唯一来源是血浆,其来源受限、工艺复杂、生产成本高,直接影响其推广应用。本研究应用生物工程技术成功制备出与HDL组分相似的rhHDL制剂,并对该制品的生物学活性进行了检测,取得以下结果:一、HDL蛋白组分的制备及中试规模的生产1.成功构建了重组人载脂蛋白的分泌型表达载体pPICZα-rhApoX,利用巴斯德毕赤酵母稳定分泌表达了rhApoA-I、rhApoA-II、rhApoC-I、rhApoC-II和rhApoE。2.利用80 L发酵罐进行了rhApoA-I和rhApoE中试规模发酵条件的优化,利用5 L摇瓶进行了rhApoA-II、rhApoC-I和rhApoC-II的高密度发酵试验,建立了适于大规模纯化上述五种载脂蛋白的新方法,收率分别为60%～70%,纯度达95%。二、rhHDL的生物学活性利用胆酸钠法,在体外将上述载脂蛋白成分与胆固醇、卵磷脂按照HDL2各成分的比例合成了rhHDL,并比较研究了rhHDL和天然HDL的生物学活性。1.细胞水平:rhHDL能介导巨噬细胞的胆固醇流出,具有进行RCT的功能。2.在体水平:rhHDL能调节实验性高脂血症大鼠的血脂代谢,显著降低TC、TG、AI和LDL-C,升高HDL-C;升高血清及组织中SOD活性从而抵抗自由基介导的脂质过氧化,防治动脉粥样硬化;减轻实验性高脂血症大鼠肝脏的脂肪沉积,达到对肝脏的保护作用。体内、外分析实验表明,本研究利用胆酸钠法制备的rhHDL具有与天然HDL极为相似的生物学活性。本研究的创新之处在于:1)建立了利用巴斯德毕赤酵母高效分泌表达rhApoA-II、rhApoC-I和rhApoE的真核表达系统;2)建立了rhApoA-I、rhApoA-II、rhApoC-I、rhApoC-II和rhApoE大规模纯化的新方法;3)利用胆酸钠法,在体外合成具有多种载脂蛋白成分的rhHDL;4)证实rhHDL具有与天然HDL极为相似的生物学活性。

论文目录

• 内容提要
• 英文缩略词
• 第1章 绪论
• 1.1 脂类代谢
• 1.1.1 胆固醇代谢
• 1.1.2 三酰甘油代谢
• 1.2 脂蛋白代谢
• 1.2.1 外源性代谢途径
• 1.2.2 内源性代谢途径
• 1.2.3 HDL 代谢——胆固醇逆转运途径
• 1.3 HDL 的载脂蛋白组分
• 1.3.1 载脂蛋白A-I
• 1.3.2 载脂蛋白A-II
• 1.3.3 载脂蛋白A-IV
• 1.3.4 载脂蛋白C-I
• 1.3.5 载脂蛋白C-II
• 1.3.6 载脂蛋白C-III
• 1.3.7 载脂蛋白E
• 1.4 HDL 的生物学功能
• 1.4.1 促进胆固醇逆转运
• 1.4.2 抗氧化作用
• 1.4.3 HDL 与抗炎作用
• 1.4.4 HDL 的其他作用
• 1.5 低HDL-C 与冠心病
• 1.6 低HDL-C 的处理措施
• 第2章 HDL 载脂蛋白成分的制备
• 2.1 rhApoA-I 的制备
• 2.1.1 材料
• 2.1.2 方法
• 2.1.3 结果
• 2.2 rhApoE 的制备
• 2.2.1 材料
• 2.2.2 方法
• 2.2.3 结果
• 2.3 rhApoA-II 的制备
• 2.3.1 材料
• 2.3.2 方法
• 2.3.3 结果
• 2.4 rhApoC-I 的制备
• 2.4.1 材料
• 2.4.2 方法
• 2.4.3 结果
• 2.5 rhApoC-II 的制备
• 2.5.1 材料
• 2.5.2 方法
• 2.5.3 结果
• 2.6 讨论
• 第3章 rhHDL 的制备及活性研究
• 3.1 rhHDL 的制备
• 3.1.1 材料
• 3.1.2 方法
• 3.1.3 结果
• 3.1.4 讨论
• 3.2 rhHDL 介导大鼠腹腔巨噬细胞内胆固醇流出
• 3.2.1 材料
• 3.2.2 方法
• 3.2.3 结果
• 3.2.4 讨论
• 3.3 rhHDL 对实验性高脂血症大鼠血脂代谢的影响
• 3.3.1 材料
• 3.3.2 方法
• 3.3.3 结果
• 3.3.4 讨论
• 研究总结
• 参考文献
• 附录
• 攻读学位期间发表的学术论文及取得的科研成果
• 致谢
• 中文摘要
• Abstract