小麦籽粒过氧化物酶（WP1）的纯化及性质研究

论文摘要

植物过氧化物酶（E.C. 1.11.1.x）是一类含血红素辅基的酶,以过氧化氢为还原剂,该酶能氧化一系列氢供体,从而参与植物的多种生理过程。如木质化作用、栓化作用、胚的形成、植物生长激素的代谢以及创伤修复和病害的防御等。小麦过氧化物酶1（Wheat Peroxidase 1,WP1）是小麦种子中最主要的一种过氧化物酶,该酶广泛存在于各小麦近缘种中。WP1属于III型植物过氧化物酶,具有氧化降解多种芳香族化合物的能力。然而关于该酶酶学性质及其在种子成熟过程中的生物学功能的研究尚未见报道。本研究利用柱层析技术分离纯化获得WP1,并对其酶学性质进行了系统分析,为该酶生物学功能的阐明和进一步开发应用奠定了基础。本研究以强筋小麦郑农16为材料。经硫酸铵分级沉淀、FPLC-SP HP离子交换柱层析、FPLC-Superdex 75凝胶过滤柱层析从小麦种子中分离得到WP1。纯化倍数为154.8,回收效率为8.6%。纯化产物在SDS- PAGE中显示为单一条带;表观分子量约为37KD。钙对WP1的酶活有促进作用,最适钙离子浓度为5 mM。分别以ABTS、TMB、愈创木酚、阿魏酸、IAA、N-乙酰酪氨酸和L-酪氨酸7种化合物为底物,测得WP1催化反应最适pH分别约为:4.15,4.36,3.92,5.42,5.80,5.35,6.30;WP1对底物ABTS的最大反应速率为6.96±0.4μM/min,Km值为0.52±0.08 mM;WP1对TMB的最大反应速率为38.81±15.2μM/min, Km值为2.45±1.2mM ; WP1对底物阿魏酸的最大反应速率为23.10±7.7μM/min,Km值为0.13±0.08 mM;WP1对底物愈创木酚的最大反应速率为24.42±3.71μM/min , Km值为16.31±3.99mM ; WP1对IAA的最大反应速率为0.84±0.11μM/min , Km值为0.09±0.03 mM ; WP1对L-酪氨酸的最大反应速率为0.19±0.04μM/min,Km值为0.13±0.10 mM;WP1对N-乙酰酪氨酸的最大反应速率为0.89±0.15μM/min,Km值为0.28±0.14 mM。纯化的WP1具有良好的稳定性,在40 mM ,pH4.8的醋酸-醋酸钠缓冲液中4℃保存数月,活力仍保持在90%以上。WP1在50℃温浴90min,活力保持在75%以上,当温度超过70℃后,WP1迅速丧失活力。钙离子可显著提高WP1的热稳定性,可将热稳定性的温度提高20℃。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1.1 过氧化物酶超家族简介
• 1.1.1 含血红素辅基的动物过氧化物酶超家族简单分类
• 1.1.2 含血红素辅基的非动物过氧化物酶超家族简单分类
• 1.2 植物过氧化物酶研究概况与进展
• 1.3 过氧化物酶（POD）的分子结构及酶学性质
• 1.3.1 POD 的分子结构特点
• 1.3.2 植物过氧化物酶的酶学性质
• 1.4 过氧化物酶的应用
• 1.4.1 应用于生物和医学领域
• 1.4.2 用于木质素降解
• 1.4.3 在化学合成工业中的应用
• 1.4.4 在环境治理方面的应用
• 1.4.5 在小麦品质改良方面的应用
• 1.4.6 在造纸工业上的应用
• 1.5 选题的目的及意义
• 第二章 实验部分
• 2.1 WP1 的分离纯化及鉴定
• 2.1.1 主要仪器和试剂
• 2.1.2 实验方法
• 2.1.3 结果与分析
• 2.1.4 讨论
• 2.2 WP1 的酶学性质研究
• 2.2.1 主要仪器和试剂
• 2.2.2 实验方法
• 2.2.3 结果与分析
• 第三章 讨论
• 3.1 WP1 的结构特点
• 3.1.1 信号肽
• 3.1.2 糖基化
• 3.1.3 空间结构的预测
• 3.2 酶学特性
• 3.2.1 对不同底物的催化能力
• 3.2.2 热稳定性
• 3.2.3 生物学功能及潜在应用
• 第四章 结论与展望
• 4.1 结论
• 4.2 展望
• 参考文献
• 致谢
• 作者简介