中药复方双龙方作用机理的系统生物学研究

论文摘要

本文采用整合化学物质组学的系统生物学研究模式对中药复方双龙方进行了研究,旨在系统地探寻双龙方的作用机理和药效分子基础,并为其他中药复方的相关研究提供参考。本研究首先通过大鼠骨髓间充质干细胞分化模型,采用免疫荧光技术鉴定心肌特异蛋白,鉴定及评价双龙方对骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化的作用效果,然后应用比较蛋白质组学的研究平台分析双龙方诱导分化过程中的差异蛋白表达,成功鉴定了13个差异表达蛋白。其中eEF2、Hspa8蛋白、Nme2、PKM2及Sl00A11等蛋白在双龙方诱导干细胞分化中具有重要作用,可能通过调节PI3K信号通路、MAPK信号通路及钙离子通路等途径参与干细胞的定向分化。其次,采用心肌细胞缺氧复氧模型,运用MTT染色法考察双龙方对心肌细胞缺氧复氧损伤的保护作用。然后利用HPLC-MS技术,对实验组细胞破碎液进行分析,筛选及鉴定双龙方中可进入心肌细胞的活性成分。MTT染色法测定结果显示,模型组细胞存活率只有8%,而双龙方干预后细胞达70%,说明双龙方干预可以有效抵抗心肌缺氧复氧损伤。经HPLC-MS分析,进入细胞活性成分主要有Re、Rg1、Rf、Rb,及Rd,均具有显著抗氧化作用,并且主要通过调节钙离子通道来起作用。再次,采用冠脉结扎致心肌梗死模型,利用基因芯片技术,寻找双龙方干预治疗心肌梗死模型大鼠的过程中差异表达基因,研究其基因水平作用机制。研究发现,双龙方干预组与模型组大鼠的差异基因表达主要与MAPK信号通路和碱基切除修复过程相关,双龙方可能通过调节MAPK通路和碱基切除修复过程起到减轻心肌损伤,保护心脏功能的作用。最后,利用冠脉结扎致心肌梗死模型,运用已建立的比较基因组学研究平台,研究不同中药复方治疗心肌缺血作用的机理。双龙方、麝香保心丸及丹红注射液对冠心病等心脏病均具有很好的疗效,利用基因芯片技术研究其在治疗心肌梗死过程中的基因表达谱变化,筛选共同差异表达的基因,研究最终筛查出了Cfb、Nfil3、Arntl和Nppa等9个基因,其可能是治疗心肌梗死中药共同的靶基因,为后续深入研究提供了重要线索。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第1章 绪论
• 1.1 中药现代化研究进展
• 1.1.1 中药复方的历史和优势
• 1.1.2 中药现代化研究现状
• 1.1.3 化学物质组学的提出
• 1.1.4 整合化学物质组学的整体系统生物学应用于中药复方现代化研究
• 1.2 干细胞研究进展
• 1.2.1 干细胞的分类
• 1.2.2 胚胎干细胞的研究进展
• 1.2.3 骨髓间充质干细胞
• 1.2.4 脂肪源性干细胞
• 1.2.5 iPS细胞
• 1.3 系统生物学研究进展
• 1.3.1 基因组学的发展及基因芯片技术的产生
• 1.3.2 基因芯片技术的应用
• 1.3.3 蛋白质组学简介及比较蛋白质组学的产生背景
• 1.3.4 比较蛋白质组学的技术平台与应用
• 1.4 本课题研究背景、研究内容及意义
• 1.4.1 研究背景
• 1.4.2 研究基础
• 1.4.3 本课题的研究思路
• 1.4.4 本课题的研究目的
• 第2章 双龙方干预大鼠骨髓间充质干细胞体外定向分化研究
• 2.1 本章引论
• 2.2 实验部分
• 2.2.1 实验试剂、仪器及实验动物
• 2.2.2 实验所用药物
• 2.2.3 大鼠骨髓间充质MSCs的分离培养
• 2.2.4 大鼠乳鼠心肌细胞的分离培养
• 2.2.5 大鼠MSCs体外诱导实验分组
• 2.2.6 MSCs分化心肌样细胞鉴定
• 2.2.7 蛋白提取
• 2.2.8 二维电泳（2-DE）
• 2.2.9 蛋白检测
• 2.2.10 图像分析
• 2.3 结果与讨论
• 2.3.1 细胞形态变化
• 2.3.2 免疫荧光分析
• 2.3.3 双龙方干预干细胞分化差异蛋白鉴定
• 2.3.4 双龙方干预干细胞分化差异蛋白功能解析
• 2.3.5 结果讨论
• 2.4 本章小结
• 第3章 双龙方对心肌损伤预保护作用机理研究及其活性成分筛选
• 3.1 本章引论
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 试剂、仪器与分析方法
• 3.2.2 心肌细胞培养、H/R造模与实验分组
• 3.2.4 心肌细胞存活率的测定方法
• 3.2.5 心肌细胞破碎液提取
• 3.3 结果与讨论
• 3.3.1 心肌细胞存活率测定结果
• 3.3.2 药物对心肌细胞H/R损伤后存活率的影响
• 3.3.3 液相色谱与质谱联用测定结果
• 3.4 讨论
• 3.4.1 双龙方对心肌细胞H/R损伤的保护作用
• 3.4.2 双龙方抵抗心肌H/R损伤的可能的药效物质
• 3.5 本章小结
• 第4章 双龙方治疗心肌缺血作用机理的比较基因组学研究
• 4.1 本章引论
• 4.2 实验部分
• 4.2.1 实验条件
• 4.2.2 动物模型建立及给药处理过程
• 4.2.3 总RNA分离及纯化
• 4.2.4 总RNA质量控制
• 4.2.5 芯片杂交前预处理
• 4.2.6 表达谱芯片杂交样本前处理
• 4.2.7 表达谱芯片杂交与扫描
• 4.2.8 芯片数据提取与处理
• 4.3 实验结果与讨论
• 4.3.1 模型及给药大鼠生理及病理分析结果
• 4.3.2 总RNA的质控结果及芯片质量控制
• 4.3.3 芯片聚类分析结果
• 4.3.4 差异基因的基因功能及代谢通路分析
• 4.3.5 讨论
• 4.4 本章小结
• 第5章 比较基因组学研究不同中药复方治疗心肌缺血的作用机理
• 5.1 本章引论
• 5.2 实验部分
• 5.2.1 实验试剂、药物及采用的动物模型
• 5.2.2 实验分组及给药
• 5.2.3 实验样本的获取
• 5.2.4 总RNA的分离鉴定、芯片杂交及数据处理
• 5.3 实验结果
• 5.3.1 心肌缺血模型组数据分析
• 5.3.2 中药复方双龙方数据分析
• 5.3.3 中药复方麝香保心丸数据分析
• 5.3.4 中药复方丹红注射液数据分析
• 5.3.5 数据联合分析
• 5.4 本章小结
• 第6章 全文总结
• 参考文献
• 致谢
• 学术论文