论文摘要
研究背景:脑胶质瘤是脑内最常见的原发性肿瘤,呈侵袭性生长,恶性程度快速发展,并且复发率和死亡率很高。患者生存期短、预后差,给治疗带来极大的困难。低级别脑胶质瘤一旦复发,恶性程度快速演进,生存期明显下降。若能阻断或延缓低级别脑胶质瘤的恶性演进,对改善患者预后和赢得治疗时间具有重要意义。PTEN（phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome 10）和p53（又称tumor protein p53,TP53）作为两个与细胞周期阻滞,细胞分化及细胞凋亡相关的重要抑癌基因,两者之间的相互调控在脑胶质瘤恶性演进过程中的作用至今尚未阐明。而且突变的p53不仅是抑癌功能的失活,而且获得了促癌的能力,称为获得性功能（gain-of-function,GOF）。脑胶质瘤中恶性程度最高的脑胶质母细胞瘤（Glioblastoma,GBM）,可分为原发型与继发型两种,原发脑胶质母细胞瘤中,36%存在EGFR扩增,PTEN与p53的突变率分别为25%和28%;而继发脑胶质母细胞瘤是由低级别肿瘤发展而来,8%存在EGFR扩增,PTEN的突变率仅有4%,而p53的突变率高达65%。在继发GBM中PTEN突变率低和p53突变率高的现象,引起我们的关注。由于PTEN有促进p53突变体促癌功能的作用,这是否提示着在PTEN不突变的低级别脑胶质瘤中,由于p53突变体的促癌功能而更容易发生恶性演进?目的:以PTEN野生型和p53突变型的脑胶质瘤细胞系SWO-38为研究模型,通过比较PTEN在突变型与野生型p53脑胶质瘤细胞中的功能差异,以及PTEN磷酸化对其功能的影响,探讨PTEN在脑胶质瘤中功能失活的机制及在脑胶质瘤恶性演进中的作用。方法:1.PCR扩增SWO-38细胞p53基因的突变热点——第5、6、8外显子并测序,明确其突变位点。以PTEN和p53均为突变型的脑胶质瘤细胞系U251为对照,运用免疫细胞化学和免疫荧光检测p53、nestin的表达;Western blot法检测GFAP、MMP-2和MTA1的表达水平;WST-8法检测细胞增殖能力;Transwell实验检测细胞迁移和侵袭能力。比较SWO-38与U251细胞的生物学特征。2.设计针对野生型PTEN的特异性siRNA,干扰SWO-38细胞中PTEN的表达,Western blot法检测干扰前后PTEN蛋白表达水平的变化以及对p53表达的影响;WST-8法检测细胞增殖能力的变化;流式细胞术检测细胞周期的改变;Transwell实验检测细胞迁移能力。同时构建野生型PTEN的重组腺病毒表达载体（Ad-PTEN）,感染脑胶质瘤细胞系U87细胞（PTEN突变型,p53野生型）,运用上述方法检测细胞增殖能力、细胞周期和细胞迁移能力的改变,比较PTEN在突变型和野生型p53细胞中的功能差异。3.Western blot法检测SWO-38细胞及其亚系Z1、Z2中总PTEN、磷酸化PTEN、MMP-2和MTA1的表达水平,以及DRB（CK2抑制剂）处理后,SWO-38细胞PTEN的磷酸化水平的变化;WST-8法检测DRB对SWO-38细胞增殖能力的影响。结果:1脑胶质瘤细胞系SWO-38的生物学特征1.1 SWO-38细胞p53基因的第5、第6和第8外显子经PCR扩增,分别得到长度为248、181和231 bp的片段,与预期一致。测序结果提交NCBI BLASTserver（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）比对,结果显示第5、第6外显子的序列与人野生型p53基因完全一致,第8外显子存在一错义突变,位于p53基因的第280号密码子,AGA突变为ACA,编码的氨基酸由R（精氨酸）变为T（苏氨酸）,该突变位点表示为R280T。免疫细胞化学结果显示,p53在SWO-38细胞核中阳性表达,呈现棕黄色颗粒。1.2 WST-8法测定生长曲线,结果表明SWO-38和U251细胞的增殖能力存在明显的。SWO-38生长速度明显快于U251,到第5天时U251仍处于平台期,SWO-38已开始进入衰亡期。1.3在迁移实验中,SWO-38细胞迁移至Transwell小室滤膜下表面的细胞密度明显小于U251细胞,而且细胞数经WST-8法检测的吸光值分别为0.316±0.029和1.297±0.035,差异有统计学意义（P＜0.05）,表明SWO-38细胞迁移能力大大低于U251细胞。而侵袭实验中,两者的细胞密度和吸光值分别为0.478±0.027和0.481±0.034,差异无统计学意义（P＞0.05）。表明SWO-38和U251细胞的侵袭能力无明显差别。1.4 Nestin在SWO-38和U251细胞中的表达存在差异。免疫荧光结果显示,SWO-38细胞nestin均匀分布在细胞浆,呈丝状着色。而U251细胞nestin强表达于核周,并向胞浆放射状分布。Western blot结果显示,SWO-38细胞nestin蛋白在95-130KD和55-72KD处各存在一条带,而U251细胞,条带主要位于250KD左右,95-130KD和55-72KD的条带表达较弱。两者nestin蛋白的分子量明显不同,SWO-38细胞为中低分子量,U251细胞主要为高分子量。1.5 Western blot结果显示,PTEN在SWO-38细胞中阳性表达,而在U251细胞中表达缺失。SWO-38细胞GFAP的表达水平明显低于U251细胞。SWO-38细胞MMP-2和MTA1的表达水平明显高于U251细胞。2 PTEN在突变型和野生型p53细胞中的功能差异2.1经Western blot法验证,3对siRNA-PTEN序列以si-h-PTEN003的干扰效果最佳,明显下调了SWO-38细胞PTEN的表达水平。2.2野生型PTEN的重组腺病毒,经PCR扩增测序鉴定,感染PTEN表达缺失的U87细胞,Western blot法验证PTEN有特异性表达。2.3 WST-8法测定生长曲线,与siRNA-Control组比较,siRNA-PTEN组的SWO-38细胞增殖能力没有明显的变化（P＞0.05）。与Ad-GFP组比较,Ad-PTEN组的U87细胞的增殖能力明显受到抑制（P＜0.05）。2.4经流式细胞术检测,siRNA-Control组SWO-38细胞的G0/G1、S、G2/M各期的细胞分布为53.4±4.5%、34.5±3.4%和10.5±1.0%;siRNA-PTEN组为54.6±5.5%、36.1±3.7%和11.2±1.1%,两组比较,差异没有统计学意义（P＞0.05）。表明下调PTEN对SWO-38细胞周期无明显影响。Ad-GFP组U87细胞的G0/G1、S、G2/M各期的细胞分布为71.2±4.6%、19.3±3.4%和10.4±1.0%;Ad-PTEN组为87.5±5.3%、10.7±2.3%和2.5±0.8%,两组比较,差异有统计学意义（P＜0.05）。表明恢复表达PTEN引起U87细胞周期阻滞。2.5与siRNA-Control组比较,siRNA-PTEN组的SWO-38细胞迁移至Transwell小室下表面的数量明显增加,细胞数经WST-8法检测的吸光值分别为0.482±0.064和0.633±0.065,差异有统计学意义（P＜0.05）。与Ad-GFP组比较,Ad-PTEN组的U87细胞迁移至Transwell小室下表面的数量明显减少,细胞数经WST-8法检测的吸光值分别为0.842±0.054和0.653±0.063,差异有统计学意义（P＜0.05）。表明PTEN对SWO-38和U87细胞的迁移能力均产生抑制作用。2.6 Western blot结果显示,siRNA-Control组和siRNA-PTEN组SWO-38细胞的p53蛋白表达水平没有明显差别。3 PTEN磷酸化在SWO-38细胞及其亚系Z1、Z2中的表达3.1 Western blot结果显示,总PTEN蛋白在SWO-38细胞及其亚系Z1、Z2中的表达无差别,而位点为Ser380/Thr382/Thr383的磷酸化PTEN以Z1细胞最高。3.2在SWO-38细胞及其亚系Z1、Z2中,Western blot结果显示,MMP-2和MTA1的表达以Z1细胞最高。3.3 DRB处理组SWO-38细胞与对照组比,Western blot结果显示,总PTEN的表达没有变化,而磷酸化PTEN明显下降。3.4 DRB处理组SWO-38细胞与对照组比,经WST-8法检测细胞增殖能力也明显降低（P＜0.05）。3.5 DRB对siRNA-Control组和siRNA-PTEN组SWO-38细胞增殖能力的影响存在差异,经WST-8法检测,DRB处理后,两组吸光值分别为0.379±0.032和0.657±0.019,差异有统计学意义（P＜0.05）。结论:1.SWO-38细胞的p53基因为突变型,突变位点为R280T,是具有获得性功能（gain-of-function,GOF）的p53突变体。与U251细胞相比,SWO-38细胞的恶性程度发生了演进。SWO-38细胞的生物学特征,为研究脑胶质瘤恶性程度演进的机制和深入剖析PTEN与p53相互调节关系,提供一良好的模型。2.PTEN在野生型与突变型p53脑胶质瘤细胞中,对细胞增殖能力的影响存在差异。在突变型p53的SWO-38细胞中,PTEN对细胞增殖能力和细胞周期没有明显的影响。在野生型p53的U87细胞中,PTEN抑制了细胞的增殖能力,引起细胞周期阻滞;表明PTEN对细胞增殖的调控依赖于野生型的p53。而对细胞迁移能力均产生抑制作用,不受p53基因状态的影响。PTEN对细胞增殖与细胞迁移的调节是其两个相对独立的功能,两者的结合最终决定PTEN在肿瘤发生及恶性进展中的作用。3.在SWO-38细胞及其亚系Z1、Z2中,恶性程度最高的Z1细胞PTEN磷酸化水平最高,下调PTEN磷酸化水平可抑制细胞的增殖能力,提示PTEN磷酸化导致其功能的失活,并引起脑胶质瘤细胞的恶性程度发生演进。PTEN磷酸化是翻译后失活的重要形式。
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