柑橘溃疡病菌tale家族基因的功能研究

论文摘要

柑橘溃疡病菌（Xanthomonas citri subsp. citri, Xcc）引起的柑橘溃疡病是目前柑橘上最重要的细菌性病害之一,病害发生时树势衰弱且果实品质受到严重影响,极大地威胁着世界柑橘产业的发展。柑橘溃疡病菌通过三型分泌系统分泌效应因子与柑橘发生互作,TALe（转录激活类似效应子）作为最主要的效应因子广泛分布在溃疡病菌中。本研究从分析我国柑橘溃疡病菌tale基因遗传多样性入手,选择tale基因保守的BamHI片段作为探针,运用Southern杂交的方法,初步掌握tale基因在溃疡病菌中的分布情况以及优势tale基因型。同时以Xcc049为出发菌株,采用无标记基因敲除技术对该菌株中含有的全部tale基因进行逐一敲除突变,然后将野生型、突变体和互补体菌株接种到感病柑橘品种甜橙上,通过对不同菌株诱导下的柑橘RNA进行深度测序,从而分析不同tale基因所引起的柑橘RNA转录表达变化情况。从我国9个柑橘产区的6个柑橘品种上共收集到105个柑橘溃疡病菌株,这些菌株分别含有4-6个tale基因,依据tale基因大小及个数总共分为14种基因型（A-N）,其中G型为优势基因型,占62%；其次为B型,占19%。然而J和L基因型代表菌株缺少pthA基因（tale家族基因成员,柑橘溃疡病菌最重要的毒性因子）,它们在甜橙和葡萄柚上的毒性较含有正常pthA基因菌株要弱。我们还从来源于江西甜橙品种上分离到一类基因型为Ⅰ型的菌株,它们同样缺失pthA基因但却能产生正常的溃疡型症状,这意味着这些菌株含有一个新的类似与pthA功能的tale基因家族成员。这是我国首次报道柑橘溃疡病菌tale基因多样性,将更有助于我们了解该病原菌的致病机理。对野生型菌株Xcc049A, tale基因敲除突变菌株Xcc049B、Xcc049C、Xcc049D和Xcc049E, pthA基因互补菌株Xcc049E+pthA接种后的甜橙RNA进行深度测序,结果表明Xcc049E+pthA菌株所引起的甜橙差异表达基因最多,与Xcc049E诱导结果相比,共有112个差异基因,其中上调101个下调11个,这些差异基因中大多数与细胞分裂、DNA修复及细胞编程性死亡相关。tal-C引起的柑橘差异表达基因中有11个基因与pthA所引起的的差异表达基因一致,这也间接地表明tal-C基因功能与pthA相似。Xcc049A、Xcc049B和Xcc049C在甜橙上所产生的症状一样,且tal-A和tal-B引起的甜橙RNA差异表达基因较少,均为3个,这表明tal-A和tal-B在柑橘溃疡病菌中对毒性的贡献不大,它们属于冗余的一类tale家族基因成员。tale基因编码的串联重复单元12和13位氨基酸与植物启动子结合从而启动相应的抗感病反应,根据柑橘RNA深度测序的结果,挖掘PthA所结合柑橘的靶序列,将对柑橘转基因抗病育种产生重大影响。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 縮略词表（Abbreviation）
• 第一章 文献综述
• 1.1 柑橘溃疡病发生与发展
• 1.1.1 柑橘溃疡病的历史起源及地理分布情况
• 1.1.2 柑橘溃疡病的症状、危害及流行
• 1.1.3 柑橘溃疡病病原特征
• 1.1.4 柑橘溃疡病菌菌系分化
• 1.1.5 柑橘溃疡病菌命名
• 1.1.6 柑橘溃疡病菌寄主范围
• 1.1.7 柑橘溃疡病菌基因组及致病因子研究
• 1.1.8 柑橘溃疡病菌检测
• 1.1.9 柑橘溃疡病的防治
• 1.2 柑橘溃疡病菌-柑橘互作的Ⅲ型分泌系统
• 1.2.1 T3SS的遗传学基础
• 1.2.2 植物病原细菌T3SS的组成
• 1.2.3 植物病原细菌T3SS的调控
• 1.2.4 植物病原细菌T3SS的分泌性
• 1.3 柑橘溃疡病菌致病性遗传多样性研究进展
• 1.3.1 柑橘溃疡病菌AFLP多样性
• 1.3.2 柑橘溃疡病菌RFLP多样性
• 1.3.3 柑橘溃疡病菌RAPD多样性
• 1.3.4 柑橘溃疡病菌16S-23S ITS序列多样性
• 1.3.5 柑橘溃疡病菌rep-PCR多样性
• 1.3.6 柑橘溃疡病菌tale基因多样性
• 1.3.7 柑橘溃疡病菌Non-tale基因多样性
• 1.4 柑橘溃疡病菌tale家族基因研究进展
• 1.4.1 植物与病原物互作分子基础
• 1.4.2 tale家族基因的发现与命名
• 1.4.3 tale家族基因的结构特征
• 1.4.4 tale家族基因的变异
• 1.4.5 tale基因在遗传改良方面的贡献
• 1.4.6 柑橘溃疡病菌tale基因毒性及无毒性作用
• 1.4.7 柑橘溃疡病菌tale基因先天免疫抑制作用
• 1.4.8 柑橘溃疡病菌tale基因与柑橘互作
• 1.5 本研究的目的与内容
• 第二章 中国柑橘溃疡病菌tale基因遗传多样性研究
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 供试材料
• 2.1.2 培养基制备
• 2.1.3 引物设计与合成
• 2.1.4 PCR反应体系及扩增条件
• 2.1.5 主要试剂和仪器
• 2.1.6 质粒DNA的提取
• 2.1.7 基因组DNA的提取
• 2.1.8 大肠杆菌DH5α感受态细胞的制备
• 2.1.9 热击转化
• 2.1.10 Southern blot检测
• 2.1.11 柑橘溃疡病菌致病力及生长能力测定
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 柑橘溃疡病菌分离鉴定及致病性测定
• 2.2.2 中国柑橘溃疡病菌分为14种基因型
• 2.2.3 中国存在缺少pthA基因的柑橘溃疡病菌
• 2.2.4 pthA基因使缺失pthA基因型菌株恢复全毒性
• 2.3 讨论
• 第三章 柑橘溃疡病菌tale基因敲除体系建立
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 菌株和质粒
• 3.1.2 引物设计与合成
• 3.1.3 液体培养基
• 3.1.4 试剂与仪器
• 3.1.5 柑橘溃疡病菌tale基因敲除
• 3.1.6 Xcc049突变体PCR验证
• 3.1.7 Xcc049突变体Southern杂交分析
• 3.1.8 柑橘溃疡病菌质粒提取方法
• 3.1.9 Xcc049所含tale基因测序
• 3.1.10 柑橘溃疡病菌致病力及生长能力测定
• 3.1.11 柑橘溃疡病菌过敏性反应（Hypersensitive response,HR）测定
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 获得了柑橘溃疡病菌Xcc049 tale基因缺失突变体
• 3.2.2 Xcc049 tale基因缺失突变体致病性及生长能力测定
• 3.2.3 柑橘溃疡病菌Xcc049 tale基因缺失突变体过敏反应测定
• 3.2.4 柑橘溃疡病菌Xcc049 tale基因序列分析
• 3.3 讨论
• 第四章 不同tale基因影响下柑橘差异表达基因研究
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 供试材料
• 4.1.2 试剂与仪器
• 4.1.3 引物设计与合成
• 4.1.4 柑橘RNA深度测序样品准备
• 4.1.5 柑橘RNA深度测序
• 4.1.6 柑橘RNA深度测序数据获得和预处理
• 4.1.7 高质序列与参考基因组比对
• 4.1.8 基因功能注释
• 4.1.9 基因表达量计算及差异表达基因筛选
• 4.1.10 显著差异表达基因GO富集分析
• 4.1.11 显著差异表达基因KEGG通路富集分析
• 4.1.12 qPCR柑橘RNA样品准备
• 4.2 结果与分析
• 4.2.1 总RNA质量分析
• 4.2.2 柑橘表达谱原始数据量统计及测序质量分析
• 4.2.3 柑橘表达谱测序数据去杂后统计分析及与参考基因组比对
• 4.2.4 不同tale基因影响下柑橘样品之间差异表达基因比较
• 4.2.5 不同tale基因影响下柑橘差异表达基因聚类分析
• 4.2.6 qPCR验证
• 4.2.7 tal-C和pthA基因影响下柑橘共有差异表达基因
• 4.2.8 pthA基因影响下柑橘差异表达基因类别分析
• 4.2.9 不同tale基因影响下柑橘差异表达基因GO功能分析
• 4.2.10 不同tale基因影响柑橘差异表达基因KEGG pathways富集分析
• 4.3 讨论
• 第五章 总结与展望
• 5.1 我国柑橘溃疡病菌tale基因遗传多样性研究
• 5.2 不同tale基因影响下柑橘表达谱差异分析
• 参考文献
• 附录1：pBluescript和PKMS1载体的限制性酶切图谱
• 附录2：柑橘基因表达谱数据
• 附录3：博士期间已发表的文章
• 致谢