影响人β-防御素3转基因克隆山羊生产的受体因素及后代外源基因的整合检测

论文摘要

利用体细胞核移植技术生产转基因动物在畜牧业生产和生物医学领域具有重要的应用价值,然而体细胞核移植技术的总体效率仍然较低。为了提高转人β-防御素3（humanβdefension 3, hBD3）基因克隆奶山羊的生产效率,本研究比较了不同受体品种、受体发情时间与转基因克隆胚胎激活时间的同步化、受体排卵情况和排卵数对转hBD3基因克隆胚胎移植受体妊娠率的影响;运用分子生物学方法对转基因子代羊与供体细胞及产羔受体的亲缘关系进行了鉴定;并通过对转基因子代羊外源基因整合位点和拷贝数检测,确定了转基因克隆羊外源基因整合效率,为进一步进行转基因克隆羊的生产研究奠定了基础。1.影响人β-防御素3转基因克隆山羊生产的胚胎移植受体因素本研究比较了不同受体品种（西农萨能奶山羊和波尔山羊）、受体发情时间与转基因克隆胚胎激活时间的同步化、受体排卵情况和排卵数对转hBD3基因克隆胚胎移植受体妊娠率的影响。共移植受体64只,移植后30天B超检查受体妊娠率为34.4%（22/64）,其中12只在妊娠过程中流产,妊娠到期产羔受体数为10只,产羔受体率为15.6%（10/64）,共产羔14只。其中:（1）西农萨能奶山羊受体与波尔山羊受体妊娠率差异不显著（30.6% vs. 46.7%, P>0.05）;（2）受体发情时间与转基因克隆胚胎激活时间同步化为0天（同一天）组与-1天组（受体发情时间比克隆胚胎激活时间早1天）或+1天组（受体发情时间比克隆胚胎激活时间晚1天）,受体妊娠率差异显著（53.6% vs. 18.8% or 25%, P<0.05）,-1天组与1天组的妊娠率差异不显著（18.8% vs. 25%, P>0.05）;（3）受体排卵情况对受体妊娠率的影响:转基因克隆胚胎移植时卵巢上大卵泡组受体与刚排卵组受体或已排卵组受体之间差异显著（6.7% vs. 40.9% or 44.4%, P<0.05）,刚排卵组受体与已排卵组受体之间差异不显著（40.9% vs. 44.4%, P>0.05）;（4）受体排卵数为1组与≥2组的受体,受体妊娠率差异不显著（33.3% vs. 48.4%, P>0.05）。2.转基因克隆羊与供体细胞及产羔受体的亲缘关系鉴定利用聚合酶链式反应-单链构象多态性（PCR-SSCP）技术检测转基因克隆子代羊与供体细胞及产羔受体的亲缘关系。结果显示,所检测转基因克隆子代羊遗传物质均来源于转基因供体细胞,与产羔受体没有亲缘关系。3.转基因克隆羊外源基因整合检测转基因克隆羊外源基因整合检测结果为:（1）多重PCR检测转基因克隆子代羊的外源基因整合情况,结果显示,转基因子代羊基因组内整合了hBD3基因和neo基因（抗性基因）;（2）Southern杂交检测外源基因的拷贝数,结果显示,hBD3基因以低拷贝形式整合到转基因克隆子代羊基因组内;（3）热不对称交错PCR检测外源基因的整合位点,结果显示,hBD3基因整合到转基因子代羊的4号染色体上。研究结果表明,在进行转基因克隆胚胎移植时,应选择发情时间与转基因体细胞核移植克隆胚胎激活时间同步化,且已经排卵的受体;所检测的转基因克隆子代羊均来源于转基因供体细胞,与产羔受体没有亲缘关系;所检测转基因克隆子代羊均为转hBD3基因山羊。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 文献综述
• 第一章 转基因动物生产方法及应用前景
• 1.1 转基因动物的主要生产方法
• 1.1.1 原核显微注射法
• 1.1.2 病毒转染法
• 1.1.3 精子载体法
• 1.1.4 胚胎干细胞介导法
• 1.1.5 体细胞核移植法
• 1.2 转基因动物的应用
• 1.2.1 提高动物的抗病能力
• 1.2.2 提高动物的生产性能
• 1.2.3 生产生物药物
• 1.2.4 人类器官移植源的生产
• 1.3 转基因动物存在的问题
• 1.3.1 转基因动物的生产效率低
• 1.3.2 外源基因对转基因动物的影响
• 1.3.3 转基因动物外源基因的效果不稳定
• 1.3.4 转基因动物的安全性问题
• 第二章 转基因动物外源基因检测研究进展
• 2.1 转基因动物外源基因的检测方法
• 2.1.1 PCR 法
• 2.1.2 Southern 杂交法
• 2.1.3 实时荧光定量PCR 法
• 2.1.4 反向PCR 法
• 2.1.5 热不对称交错PCR 法
• 2.1.6 荧光原位杂交法
• 2.2 转基因动物外源基因检测技术中存在问题及展望
• 试验研究
• 第三章 影响转人β-防御素3 基因克隆山羊生产的胚胎移植受体因素
• 3.1 材料和方法
• 3.1.1 主要试剂
• 3.1.2 主要仪器
• 3.1.3 转基因表达载体
• 3.1.4 受体母羊选择
• 3.2 试验方法
• 3.2.1 卵母细胞成熟培养
• 3.2.2 转基因供体细胞准备
• 3.2.3 转基因阳性细胞核移植
• 3.2.4 克隆胚胎激活和培养
• 3.2.5 克隆胚胎移植和受体妊娠诊断
• 3.2.6 数据处理
• 3.3 结果
• 3.3.1 受体羊品种对转基因克隆胚胎移植妊娠率和产羔受体率的影响
• 3.3.2 受体发情时间与转基因克隆胚胎激活时间同步化对受体妊娠率和产羔受体率的影响
• 3.3.3 受体排卵情况对妊娠率和产羔受体率的影响
• 3.3.4 受体排卵数对妊娠率和产羔受体率的影响
• 3.4 讨论
• 3.5 小结
• 第四章 转人β-防御素3 基因克隆山羊的亲缘关系的鉴定
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 试验样本
• 4.1.2 主要试剂
• 4.1.3 主要仪器
• 4.2 试验方法
• 4.2.1 基因组的提取
• 4.2.2 转基因克隆羊亲缘关系的鉴定
• 4.3 结果
• 4.3.1 转基因克隆羊亲缘关系的鉴定结果
• 4.4 讨论
• 4.5 小结
• 第五章 转人β-防御素3 基因克隆山羊外源基因整合检测
• 5.1 材料与方法
• 5.1.1 试验样本
• 5.1.2 主要试剂
• 5.1.3 主要仪器
• 5.2 试验方法
• 5.2.1 多重PCR 对转hBD3 基因奶山羊的检测
• 5.2.2 Southern 杂交对转hBD3 基因奶山羊的检测
• 5.2.3 热不对称PCR 对转hBD3 基因奶山羊的检测
• 5.3 结果
• 5.3.1 多重PCR 对转hBD3 基因奶山羊的检测结果
• 5.3.2 Southern 杂交对转hBD3 基因奶山羊的检测结果
• 5.3.3 热不对称PCR 转hBD3 基因奶山羊的检测结果
• 5.4 讨论
• 5.5 小结
• 结论
• 参考文献
• 缩略词
• 致谢
• 作者简介