青蒿琥酯的细胞膜毒性及健康人淋巴细胞和Jurkat细胞形态和力学的研究

论文摘要

本学位论文主要分为两大部分：（1）结合AFM探讨了药物青蒿琥酯的细胞膜毒性及其可能作用机制；（2）应用AFM探测健康人淋巴细胞和淋巴白血病Jurkat细胞的形态、细胞弹性的不同,结合共聚焦显微镜、流式细胞仪探讨了细胞膜的弹性与细胞骨架的关系。本文第一部分,目前国内外关于药物的细胞膜毒性的研究报道不多。青蒿琥酯是水溶性抗癌药物。尚未见报道青蒿琥酯通过细胞膜毒性机制杀死肿瘤细胞。细胞功能的正常有赖于膜结构的完整及膜特性的保持。药物导致的细胞膜酶活性异常改变,会干扰细胞膜的正常生理功能,进而造成细胞膜结构和功能的广泛损伤。这些可能是某些药物毒性作用的重要机制。本实验探讨不同浓度的青蒿琥酯对Jurkat细胞的膜毒性。方法：利用CCK-8法检测青蒿琥酯抑制Jurkat细胞的生长,倒置荧光显微镜观察Jurkat细胞变化,及应用AFM探测细胞膜表面超微结构及弹性变化。为探讨细胞膜的弹性变化与细胞骨架相关,应用荧光染色结合流式细胞仪检测细胞膜表面integrinβ1的表达及细胞骨架蛋白F-actin和Tubulin-β的变化。为进一步探讨青蒿琥酯对Jurkat细胞膜的影响,利用ATP酶试剂盒检测Jurkat细胞膜Ca2+-Mg2+-ATPase及Na+-K+-ATPase活性的变化,细胞膜荧光染料DiBAC4（3）检测Jurkat细胞膜电位的变化。为探讨青蒿琥酯对细胞内部蛋白的影响,利用Western blot检测细胞内CyclinD1、Caspase3的蛋白表达。选用50μg／ml青蒿琥酯处理健康人淋巴细胞,利用AFM观察其形貌变化,LDH试剂盒检测其LDH含量变化。结果：随着青蒿琥酯浓度升高,Jurkat细胞存活率降低。倒置荧光显微镜观察到细胞数目不断减少。AFM图像显示经低浓度药物作用的Jurkat细胞膜呈现起伏不平,局部可见细小孔洞；随药物作用浓度增加,细胞发生变形,塌陷,细胞高度降低,膜皱缩,细胞膜表面孔洞大小、深度增加。AFM的力谱结果显示,50μg／ml药物作用的细胞弹性小于对照组。流式结果显示作用药组的细胞膜整合素integrinβ1表达量较对照组减少,但不明显。骨架蛋白F-actin含量下降明显,β-tubulin含量变化不大。表明青蒿琥酯影响到细胞骨架蛋白F-actin,进而改变细胞形态及细胞弹性。50 gg／ml药物使细胞膜Ca2+Mg2+-ATPase、Na+-K+-ATPase活性下降,使膜电位升高,呈去极化状态。浓度达到200μg／ml时,细胞膜发生了超极化,浓度达到400μg／ml时,药物对细胞膜的损伤不可逆。Westernblot结果显示青蒿琥酯细胞内CyclinD1蛋白表达降低,Caspase3蛋白表达升高。50μg/ml青蒿琥酯作用下,健康人淋巴细胞形貌变化不大,LDH含量下降不明显。表明此浓度的青蒿琥酯对正常细胞副作用小。影响取得的研究结果如下：50μg／ml青蒿琥酯对Jurkat细胞生长有明显抑制作用,对细胞膜表面ATP酶活性有明显抑制作用,还引起细胞膜去极化,且其效应在一定范围内随浓度增加而增大,并抑制CyclinD1蛋白的表达,从而阻滞细胞周期进程。推断青蒿琥酯对肿瘤Jurkat细胞的膜毒性,可能是药物造成细胞死亡的一个机制。本文第二部分,基于原子力显微镜的超高分辨率和力谱特性,探测了健康人淋巴细胞和淋巴白血病Jurkat细胞的形态、粘弹力和杨氏模量的不同,并结合共聚焦显微镜、流式细胞仪,探讨了细胞膜弹性与细胞骨架蛋白的关系。方法：选取健康人淋巴细胞、淋巴白血病Jurkat细胞为研究对象,每组随机选取10个细胞,应用AFM并对每组的10个细胞进行扫描,对每个细胞膜表面1μm区域的平均粗糙度、纳米粒子高度进行测量及探测细胞弹性,对比观察两组细胞膜表面的纳米结构变化及力学变化,找出正常细胞与肿瘤细胞的形貌、膜弹性的不同。利用共聚焦显微镜观察这两种细胞的骨架F-actin蛋白排布,流式细胞仪检测这两种细胞的F-actin和Tubulin-β蛋白含量。AFM探测细胞松弛素B对这两种细胞形态和力学性质的影响。取得研究结果如下：（1）通过观察发现健康淋巴细胞、淋巴白血病Jurkat细胞的形貌和超微结构存在着显著的差异,且Jurkat细胞膜表面的平均粗糙度、纳米粒子高度均明显低于健康淋巴细胞。（2）由共聚焦和流式结果显示,健康淋巴细胞骨架微丝蛋白F-actin主要集中分布在细胞核的周围,呈“环状”结构,排布均匀紧凑,部分呈细丝状分布于胞浆内。肿瘤Jurkat细胞的F-actin蛋白微丝分布稀少,不均匀甚至呈现紊乱,处于放松状态。同时,健康淋巴细胞的F-actin和Tubulin-β含量都高于Jurkat细胞。这表明骨架F-actin和Tubulin-β蛋白都对细胞膜的弹性有影响。（3）从AFM角度探讨骨架蛋白与细胞弹性的关系。AFM结果显示细胞松弛素B处理后的这两种细胞,形态和力学性能都发生了变化。淋巴细胞由圆形变成“葫芦形”,且膜上粒子聚集；Jurkat细胞的中央出现凹陷,完整性失去,膜表面出现孔洞,膜上粒子聚集。两种细胞的弹性都下降了。细胞松弛素实验再次证实Factin蛋白影响细胞膜的弹性。此项工作的研究成果,突出的表现为辨别不同种类和病变细胞提供了一个很好的参考。

论文目录

摘要

ABSTRACT

第一章前言

第一节原子力显微镜简介

1.1 原子力显微镜的构造及成像原理

1.2 原子力显微镜的工作模式

1.3 AFM成像环境、基底选择及样品准备

第二节原子力显微镜在细胞结构与功能中的应用

2.1 分析单细胞的意义与目的

2.2 原子力显微镜对细胞结构的可视化研究

2.3 细胞膜表面力学、弹性、粘度等信息的获取

2.4 AFM弹性检测在细胞生物学中的运用

第三节细胞膜毒性研究的意义

第四节展望

参考文献

第二章青蒿琥酯的细胞膜毒性研究

1 引言

2 实验材料与方法

2.1 试剂、材料

2.2 仪器

2.3 Jurkat细胞培养及分离淋巴细胞

2.4 注射用青蒿琥酯工作液的准备

2.5 细胞存活率测定

2.6 原子力显微镜样品制备

2.7 原子力显微镜扫描

2.8 整合素（integrinβ1）含量的流式检测

2.9 细胞骨架蛋白F-actin和Tubulin-β的流式检测

+-K⁺-ATP酶及Ca²⁺-Mg²⁺-ATP酶活性的测定'>3.0 细胞膜Na⁺-K⁺-ATP酶及Ca²⁺-Mg²⁺-ATP酶活性的测定

3.1 细胞膜电位测定

3.2 Western blot法检测细胞内CyclinD1和Caspase3的蛋白表达水平

3.3 酶标仪检测细胞中LDH活性

4 结果与讨论

4.1 青蒿琥酯对Jurkat细胞生长的抑制作用

4.2 倒置荧光显微镜观察Jurkat细胞

4.3 Jurkat细胞形态结构的AFM分析

4.4 Jurkat细胞的弹性分析

4.5 青蒿琥酯对Jurkat细胞膜表面整合素的影响

4.6 Western blot检测Jurkat细胞骨架F-actin和Tubulin-β蛋白

4.7 青蒿琥酯对Jurkat细胞膜表面的ATP酶的影响

4.8 流式细胞仪检测不同浓度的青蒿琥酯对Jurkat细胞膜电位的影响

4.9 青蒿琥酯作用Jurkat细胞后的CyclinD1和Caspase-3蛋白的表达情况

本章总结

参考文献

第三章原子力显微镜探测健康人淋巴细胞和JURKAT细胞

1 引言

2 实验材料与方法

2.1 实验试剂

2.2 实验使用仪器

2.3 细胞的培养

2.4 AFM样品制备

2.5 AFM成像及力谱测量

2.6 共聚焦显微镜观察细胞骨架F-actin结构排布

2.7 流式细胞仪检测细胞骨架蛋白F-actin和Tubulin-β含量

3 结果与讨论

3.1 淋巴细胞及Jurkat细胞形态结构的AFM观察

3.2 原子力显微镜探测健康人淋巴细胞和Jurkat细胞的弹性

3.3 共聚焦显微镜结合鬼笔环肽-FITC观察健康人淋巴细胞和Jurkat细胞的F-actin骨架蛋白

3.4 流式细胞仪结合鬼笔环肽-FITC及Tubulin-β-FITC荧光染料检测细胞骨架蛋白含量变化

3.5 原子力显微镜观察细胞松弛素B作用淋巴细胞和Jurkat细胞后的形貌变化

3.6 原子力显微镜观察探测细胞松弛素B作用淋巴细胞和Jurkat细胞后的弹性变化

本章总结

参考文献

附录1 英文缩略语表

附录2 攻读硕士学位期间参加科研工作基本情况

致谢

青蒿琥酯的细胞膜毒性及健康人淋巴细胞和Jurkat细胞形态和力学的研究

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