论文摘要
单增李斯特菌广泛分布于环境中,是典型的胞内寄生菌,通过污染食品引起人类李斯特菌病,因其在食品及环境中具有较高的污染率及病人的高致死率而引起关注。目前我国尚无单增李斯特菌引起人群感染暴发的报道,在所分离到的单增李斯特菌株中,遗传家系Ⅱ菌株占有非常高的比例,其中尤以ST9(29%)、ST8(11%)作为优势ST型别。本研究利用国际上通用的Structure 2.3模型聚类软件对巴斯德研究所MLST数据库中现有单增李斯特菌ST型别根据SNP位点数目多次聚类分组分析,并结合本科室收集的我国ST菌株权重,选取了25株家系Ⅱ代表菌株,通过测定生长曲线、体外细胞侵袭、溶血活性、生物膜形成量和抵抗阿米巴吞噬等表型实验方法,对家系Ⅱ菌株毒力及环境适应相关表型进行了描述和比较,以探索我国单增李斯特菌在食品与环境中的存在能力差异原因及致病性差异特征。实验结果表明,不同的家系Ⅱ菌株在体外侵袭能力、溶血活性、生物膜形成能力和抵抗阿米巴吞噬能力方面均存在差异。其中侵袭能力和生物膜形成能力作为主成分分析(PCA)中对两个主成分各自贡献最大的两个表型实验因素,可将所研究的家系Ⅱ菌株进行聚类并分为三组,第一组菌株具有强生物膜形成能力而侵袭力较低,可能长期存留在环境中但毒力却较低,其存在潜在致病能力；第二组菌株生物膜形成能力和侵袭力均比较低,说明其环境适应能力与毒力均比较弱,致病能力相对比较有限；第三组侵袭能力较高而生物膜形成能力变异较大,提示其具有较强的致病能力,而在环境中长期生存能力不确定,对人类潜在威胁最大。PCA分组结果提示单增李斯特菌的环境生存能力和致病能力可能存在一定联系。本研究对遗传家系Ⅱ单增李斯特菌毒力表型及环境相关表型特征结果进行了分析,提示家系Ⅱ菌株存在引起我国人群感染暴发流行的潜在危害性,应当引起我国食品安全及疾病预防控制相关部门的重视。同时本研究初步建立了LM环境相关表型实验技术体系,为今后更深入探索LM环境适应机制及进化研究提供了基础。单增李斯特菌生物膜形成能力是影响其环境中适应和存活能力的主要因素。LM通过在食品加工材料内表面粘附并分泌大量胞外聚合物而形成生物膜,可以在不利的环境条件下长期存留于食品及其相关环境中,从而对公共卫生产生长期威胁。LM生物膜形成机制复杂,其生物膜结构形成受许多因素的影响。目前国际上关于胞外基质(表面多糖、胞外DNA、蛋白质、聚谷氨酸、磷壁酸等)对生物膜形成的影响尚不明确,普遍认为其主要起到维持结构稳定及保护生物膜的作用。大多数研究认为,起始粘附阶段和生物膜成熟形成阶段的生物膜形成量均受到特定的相关基因转录和表达的控制。在25株家系Ⅱ菌株生物膜形成量测定结果基础上,对其中5株生物膜形成能力有明显差异的LM进行了生物膜形成不同阶段相关基因的研究。结果显示,大部分生物膜形成相关基因未发生突变或重组,或存在部分同义突变,仅有hpt、luxS、prfA、sigB在部分菌株中存在氨基酸改变,但这些基因改变与生物膜形成能力之间没有一致性。通过鞭毛蛋白编码相关基因flaA检测比对及动力试验比较结果发现,菌株的运动能力可能与生物膜形成能力存在一定联系。生物膜相关蛋白样基因bapL的表达与生物膜形成能力间的相关性尚不明确,其功能有待进一步研究证实。