甲状旁腺素相关肽核定位序列与C-末端缺失导致小鼠脑发育异常

论文摘要

甲状旁腺素相关肽（PTHrP）与甲状旁腺素（PTH）的N-末端在序列及空间构象上高度同源并可通过相同的受体——PTH／PTHrP受体（又称PTH 1型受体）发挥作用。研究表明PTHrP是一多激素，即不同的结构域具有不同功能。其中间段（37-86）参与胎盘钙转运；C-末端（108-139）具有抑制骨吸收作用。PTHrP（87-107）为核定位序列（NLS），体外研究表明PTHrP的NLS可通过细胞内分泌（intracrine）方式发挥促进细胞增殖和抑制细胞凋亡作用，PTHrP的C-末端对于NLS入核后的作用发挥必不可少。但NLS和C-末端的在体功能尚不清楚。为了研究NLS的在体功能，我们通过在小鼠PTHrP基因第84位氨基酸序列后敲入（Knock-In）一氨基酸翻译的终止子——TGA，使其只表达PTHrP（1-84），而不表达NLS和C-末端，这样就产生了PTHrP NLS和C-末端敲除小鼠（即PTHrP KI小鼠，简称KI小鼠）。纯合子KI小鼠出现生长阻滞及肌萎缩、皮肤过度角化、全身脂肪减少和骨质疏松等衰老表型。但是PTHrP KI对脑发育的影响尚未研究。PTHrP及其受体在中枢神经系统广泛表达且在大脑皮质、海马、小脑等部位高表达。为了研究PTHrP KI对小鼠脑发育的影响，我们采用胚胎（E18．5）、生后1天（P1）、P7、P14的同窝KI和野生型（WT）小鼠，分别从整体水平、组织细胞水平和分子水平研究PTHrP的NLS和C-末端缺失导致的小鼠脑发育异常。整体观察表明：KI小鼠的脑较轻、吻尾径缩短、嗅球短小、大脑皮质前部较薄、小脑较小。说明PTHrP的NLS和C-末端在维持脑正常发育中起重要作用。通过增殖细胞核抗原（PCNA）免疫组化染色，发现KI小鼠的室下带、海马和小脑中PCNA阳性细胞数都较同窝的WT小鼠明显减少；Caspase-3免疫组化和TUNEL染色阳性细胞在KI小鼠齿状回部位明显增加；Western Blot结果表明，KI小鼠的细胞周期依赖性激酶抑制因子（CDKI）P16、P21、P27、P53都明显升高。这些结果说明PTHrP的NLS和C-末端可通过下调CDKI表达而抑制脑细胞凋亡、刺激神经干细胞增殖，从而促进脑发育。神经元特异性核蛋白（NeuN）免疫组化结果表明，KI小鼠齿状回的NeuN阳性神经元百分率从出生至P14天均较WT小鼠低；在大脑皮质，其阳性细胞百分率在E18．5和P1较WT小鼠为低，而从P7至P14，其阳性百分率则与WT小鼠相近，但其平均大小则明显小于同窝WT小鼠。通过胆碱乙酰转移酶（ChAT）免疫组化染色发现，P7和P14天的KI小鼠脑干面神经核ChAT阳性产物总灰度值较WT小鼠明显降低。实时荧光定量RT-PCR结果表明在P1至P14天的KI小鼠脑钙结合蛋白D-28k的mRNA水平均较WT小鼠明显下调。钙结合蛋白D-28k的阳性产物面积和总灰度值在P14天的KI小鼠齿状回、纹状体和小脑蒲肯野细胞均明显降低。这些结果说明PTHrP的NLS和C-末端能够促进神经元的分化和成熟，并可通过上调钙结合蛋白D-28k而促进正常神经元功能的发挥并具防止神经元退变的作用。胶质纤维酸性蛋白（GFAP）免疫组化结果表明，在海马、小脑和P14天的室下带部位KI小鼠的GFAP阳性细胞和纤维与WT小鼠无明显差异。但在室下带部位KI小鼠的GFAP阳性结构从E18．5至P7天均较WT小鼠少，并伴有室下带细胞向大脑皮质迁移的延迟和小脑皮质外颗粒层细胞内向颗粒层迁移延迟。髓鞘碱性蛋白（MBP）免疫组化检测发现KI小鼠MBP阳性结构在脑不同部位均较WT小鼠明显减少。MBP的Western Blot检测结果与免疫组化结果一致。这些结果表明PTHrP的NLS和C-末端能够：①促进星形胶质细胞在室下带和小脑的分化，从而加速细胞从室下带向大脑皮质或从小脑外颗粒层向内颗粒层迁移。②促进少突胶质细胞分化和髓鞘形成。对新鲜脑表面血管的观察发现P14天的KI小鼠脑血管较WT小鼠明显细小。荧光定量RT-PCR检测发现血小板／内皮细胞粘附分子（PECAM-1，又称CD31）和血管内皮细胞生长因子（VEGF）的mRNA水平在P7和P14天KI小鼠均明显低于WT小鼠。VEGF的Western Blot结果与荧光定量RT-PCR结果一致。这些结果说明PTHrP的NLS和C-末端可通过促进脑血管的发生而促进脑发育。本课题对KI小鼠脑发育不良进行了较系统的研究，包括脑形态观测、脑细胞增殖、分化、迁移、凋亡及脑血管发生检测。结果证明PTHrP KI引起了脑形态异常、神经干细胞增殖能力降低和细胞凋亡增加。这些改变可能与上调P16、P21、P27和P53等CDKI有关。PTHrP KI也造成了脑细胞迁移、分化和成熟的延迟及髓鞘形成和脑血管发生异常。这些发现充分说明PTHrP的NLS和C-末端可通过促进脑细胞增殖、迁移、分化、血管发生和抑制脑细胞凋亡而在小鼠脑发育中起重要作用。PTHrP NLS和C-末端的这些作用提示其在中枢神经系统疾病（如神经退行性病变和中风等）的治疗方面具有潜在的临床应用价值。

论文目录

• 缩写词
• 中文摘要
• 英文摘要
• 引言
• 材料与方法
• 1.实验动物
• 2.动物基因型鉴定
• 3.免疫组织化学实验
• 4.实时荧光定量RT-PCR实验
• 5.蛋白印迹（Western Blot）试验
• 6.统计分析
• 结果
• 1.PTHrP KI对脑形态发生的影响
• （1）PTHrP KI对小鼠外形和体重变化的影响
• （2）PTHrP KI对小鼠的脑外形和脑重变化的影响
• （3）PTHrP KI对小鼠脑矢状面形态学变化的影响
• 2.PTHrP KI对脑细胞增殖和凋亡的影响
• （1）PTHrP KI对脑细胞增殖的影响
• （2）PTHrP KI对脑细胞凋亡的影响
• （3）PTHrP KI对细胞周期依赖性激酶抑制因子的影响
• 3.PTHrP KI对神经元分化的影响
• （1）PTHrP KI对神经元发育成熟的影响
• （2）PTHrP KI对胆碱能神经元发育的影响
• （3）PTHrP KI对钙结合蛋白D-28k在脑组织中表达的影响
• 4.PTHrP KI对神经胶质细胞发育的影响
• （1）PTHrP KI对星形胶质细胞发育的影响
• （2）PTHrP KI对少突胶质细胞发育的影响
• 5.PTHrP KI对脑血管发生的影响
• 讨论
• 1.PTHrP KI造成脑内脑细胞增殖降低和凋亡增加
• 2.PTHrP KI导致脑内神经元分化延迟
• （1）PTHrP KI延迟脑内神经元发育成熟和迁移
• （2）PTHrP KI延迟脑内胆碱能神经元发育
• （3）PTHrP KI延迟脑内钙结合蛋白D-28k阳性神经元发育
• 3.PTHrP KI导致脑内星形胶质细胞发育异常
• 4.PTHrP KI延迟脑内少突胶质细胞发育及髓鞘形成
• 5.PTHrP KI致脑血管发生异常
• 结论
• 小结
• 参考文献
• 致谢
• 附录