牡丹花芽内休眠解除相关基因的分离与功能分析

论文摘要

牡丹是中国传统十大名花之一,正如许多多年生木本植物一样,每年冬季其花芽都将进入休眠状态,而且必须经过一定时期的低温处理才能彻底解除休眠,保证来年正常的开花展叶。牡丹花芽的休眠是典型的内休眠,迄今为止,对于内休眠调控的分子机理还知之甚少。以牡丹为材料,分离芽休眠调控的相关基因,研究其分子功能,对于揭示芽内休眠机理,人为调控花期,保证反季节催花的成功,具有重要的理论意义和实践价值。本研究以牡丹品种‘鲁荷红’为试材,通过观察自然低温条件下花芽的形态解剖变化,确定了花芽休眠解除的进程,认为冬季自然低温条件下（日平均气温为0-10℃）处理30-35d可彻底解除休眠。利用抑制性差减杂交（SSH）技术,以休眠解除芽的RNA为“tester”,休眠芽的RNA为“driver”,构建花芽休眠解除相关基因的差减cDNA文库,共筛选到31个与内休眠解除相关的差异基因,根据blast分析结果进行其分子功能预测,可将这31个基因分为9类:（1）结构功能:PsRPS7A,PsRPSL21,PsRPS,PsRPSL10,PsRPS7B,PsEDR,PsRPSL37,PsRPSL19,PsRPSL1,PsRPSL15,PsTUB;（2）激酶活性:PsSERK1;（3）蛋白质结合活性:PsXRCC1和PsPOB;（4）其他物质结合活性:PsMPT;（5）转运子活性:PsAEP;（6）其他酶活性:PsGA20和PsSAMT;（7）其他分子功能:PsPII;（8）未知功能基因:PsBDR1,PsBDR2,PsARP,PsFB2,PsCXE,PsDHN;（9）无blast匹配序列:PsBDR3-8。根据候选基因的功能推测和前人关于植物休眠调控的研究结果,选取了8个可能与内休眠解除相关的基因（PsPII,PsDHN,PsGA20,PsARP,PsMPT,PsCXE,PsSERK1和PsPOB）,采用northern blot和RT-PCR技术分析了它们在花芽内休眠解除不同时期的表达模式变化,认为牡丹花芽内休眠解除的过程伴随着复杂物质代谢和能量消耗,差异基因主要参与植物生长发育及抗性胁迫等方面的调控,而且低温诱导的核糖体蛋白的表达可能也与花芽内休眠解除有关。为了深入研究生长素抑制蛋白基因（PsARP）在花芽内休眠解除过程中的分子作用,通过RACE-PCR技术扩增了其cDNA全长,对其编码的蛋白质氨基酸序列进行生物信息学分析,认为牡丹中该基因属于ARP/DRM基因家族,含有两个保守结构域,无信号肽及跨膜结构域。PsARP基因的亚细胞定位研究进一步证明该基因编码的蛋白为一细胞质蛋白。不同低温处理条件下,PsARP的表达模式变化的研究表明,该基因在低温诱导牡丹花芽内休眠解除过程中的表达量逐渐升高,高表达的PsARP mRNA可在正常生长条件下被恢复,表明该基因在花芽内休眠解除过程中可能起促进作用,但对正常生长条件下花芽发育的作用不大,推测PsARP的表达变化与花芽内束缚生长素和自由生长素之间的转变有关,自由生长素通过与生长素抑制蛋白（PsARP）基因相互作用,从而在转录后水平上调控花芽内休眠的进程,间接说明了生长素在调控花芽内休眠解除过程中也起一定的作用。PsARP在拟南芥中的超表达研究表明,转基因植株与野生型植株的表型差异不大,进一步说明该基因在植物生长发育过程中的作用不大。线粒体磷酸转移子基因（PsMPT）是从差减cDNA文库筛选到的另一在低温诱导花芽内休眠解除过程中表达量明显升高的克隆。通过RACE-PCR技术扩增PsMPT的全长cDNA序列,对其编码的蛋白质氨基酸序列进行生物信息学分析,发现PsMPT与其他物种中分离到的线粒体磷酸转移子（MPTs）的氨基酸序列相似性很高,均具有六个保守的跨膜结构域,而且其活性中心含有一个保守的半胱氨酸（Cys）残基。采用northern blot技术进一步分析PsMPT在不同低温处理条件下的表达模式变化,发现PsMPT的表达模式变化与花芽内休眠解除的进程及花芽内ATP含量的变化相吻合,推测PsMPT为一冷诱导表达基因,在花芽内休眠解除过程中,高表达的PsMPT促进ATP的合成,提高植物体内ATP/ADP的比值,从而使花芽内休眠解除所需的相关蛋白大量合成,彻底解除花芽内休眠。迄今为止,本研究首次证明了线粒体磷酸转移子参与花芽内休眠解除的过程,初步揭示了休眠解除过程伴随着ATP含量显著增加的分子机理。另外,PsMPT在拟南芥中的超表达研究表明,转基因拟南芥不同发育阶段的植株鲜重、叶片长度及叶片中ATP含量均比野生型植株的相应指标高,而且开花期提前4-5天,进一步说明了该基因的超表达增加了ATP的合成,促进了植株的生长发育。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 1 绪论
• 1.1 植物芽休眠调控机理的研究进展
• 1.1.1 芽休眠概述
• 1.1.1.1 芽休眠的定义
• 1.1.1.2 芽休眠的分类
• 1.1.1.3 芽休眠的生物学意义
• 1.1.2 芽休眠调控机理的研究进展
• 1.1.2.1 类休眠调控机理的研究进展
• 1.1.2.2 内休眠调控机理的研究进展
• 1.1.2.3 生态休眠调控机理的研究进展
• 1.1.3 亟待解决的问题
• 1.2 牡丹芽内休眠调控的研究进展
• 1.2.1 牡丹芽的内休眠特性
• 1.2.2 牡丹芽内休眠的调控
• 1.2.2.1 低温在牡丹芽内休眠解除过程中起到质的作用
• 1.2.2.2 外源激素对牡丹内休眠的解除具有辅助作用
• 1.3 差异表达基因的筛选方法
• 1.3.1 几种筛选差异表达基因的技术原理
• 1.3.1.1 差异显示PCR
• 1.3.1.2 代表性差异显示分析技术
• 1.3.1.3 基因表达系列分析技术
• 1.3.1.4 抑制性差减杂交
• 1.3.1.5 DNA 微阵列
• 1.3.1.6 几种基因差异表达分析技术的优缺点比较
• 1.3.2 本研究采用的抑制性差减杂交（SSH）
• 1.3.2.1 抑制性差减杂交的技术流程
• 1.3.2.2 抑制性差减杂交技术在分离植物差异表达基因中的应用
• 1.4 本项研究的目的和意义
• 1.4.1 研究目的
• 1.4.2 研究意义
• 1.5 本项研究的技术路线
• 2 牡丹花芽内休眠解除相关基因的分离
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 试验材料
• 2.1.1.1 植物材料
• 2.1.1.2 质粒及菌种
• 2.1.1.3 试剂
• 2.1.2 方法
• 2.1.2.1 牡丹花芽内休眠解除过程中的形态解剖结构观察
• 2.1.2.2 牡丹花芽总RNA 的提取及检测
• 2.1.2.3 总RNA 中基因组DNA 的酶解
• 2.1.2.4 mRNA 的纯化
• 2.1.2.5 mRNA 的浓缩
• 2.1.2.6 抑制性差减杂交（SSH）
• 2.1.2.7 应用T/A 克隆法构建正向差减文库
• 2.1.2.8 差示筛选差减cDNA 文库
• 2.1.2.9 DNA 测序与序列分析
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 牡丹花芽内休眠进程中形态解剖结构变化及内休眠时期的确定
• 2.2.2 CTAB 法提取的总RNA 完整性和纯度检测
• 2.2.3 RsaⅠ酶切效率检测
• 2.2.4 抑制性差减杂交后二次PCR 产物分析
• 2.2.5 差减cDNA 文库的构建及阳性克隆的筛选
• 2.2.6 牡丹花芽内休眠解除相关基因的Blast 分析及功能分类
• 2.3 讨论
• 2.3.1 牡丹花芽总RNA 的提取
• 2.3.2 差减cDNA 文库的筛选及差异基因冗余性
• 2.3.3 休眠解除相关基因涉及生命活动的多个方面
• 3 牡丹花芽内休眠解除过程中差异基因的表达模式分析
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 试验材料
• 3.1.1.1 植物材料
• 3.1.1.2 试剂
• 3.1.2 方法
• 3.1.2.1 Northern blot 分析
• 3.1.2.2 RT-PCR 分析
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 不同时期牡丹花芽总RNA 的提取
• 3.2.2 花芽内休眠解除过程中差异基因表达模式的northern blot 分析
• 3.2.3 花芽内休眠解除过程中差异基因表达模式的RT-PCR 分析
• 3.3 讨论
• 3.3.1 PsPII 和PsMPT 基因的表达模式分析
• 3.3.2 PsARP 和PsGA20 基因的表达模式分析
• 3.3.3 PsSERK1 基因的表达模式分析
• 3.3.4 PsDHN 和PsCXE 基因的表达模式分析
• 3.3.5 低温诱导的核糖体蛋白的表达可能与花芽内休眠的解除有关
• 4 牡丹生长素抑制蛋白基因的功能分析
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 材料
• 4.1.1.1 试验材料及其处理
• 4.1.1.2 菌种
• 4.1.1.3 试剂
• 4.1.2 方法
• 4.1.2.1 PsARP 基因全长cDNA 的扩增（RACE-PCR）
• 4.1.2.2 蛋白质的生物信息学分析
• 4.1.2.3 PsARP 的亚细胞定位
• 4.1.2.4 不同处理条件下PsARP 的northern blot 分析
• 4.1.2.5 PsARP 的超表达转基因研究
• 4.2 结果与分析
• 4.2.1 PsARP 基因cDNA 全长的克隆
• 4.2.2 PsARP 编码的蛋白质的生物信息学分析
• 4.2.2.1 同源性比较
• 4.2.2.2 功能结构域分析
• 4.2.2.3 跨膜结构域分析
• 4.2.2.4 信号肽分析
• 4.2.2.5 系统进化树分析
• 4.2.3 PsARP 的亚细胞定位
• 4.2.4 不同处理条件下PsARP 的表达模式变化
• 4.2.5 PsARP 超表达转基因植株的表型分析
• 4.3 讨论
• 4.3.1 PsARP 编码的蛋白质结构分析
• 4.3.2 PsARP 编码的蛋白质功能分析
• 5 牡丹线粒体磷酸转移子基因的功能分析
• 5.1 材料与方法
• 5.1.1 材料
• 5.1.1.1 试验材料及其处理（同4.1.1.1）
• 5.1.1.2 菌种（同4.1.1.2）
• 5.1.1.3 试剂（同4.1.1.3）
• 5.1.2 方法
• 5.1.2.1 PsMPT 基因全长cDNA 的扩增（RACE-PCR）
• 5.1.2.2 蛋白质的生物信息学分析
• 5.1.2.3 PsMPT 的亚细胞定位
• 5.1.2.4 不同处理条件下PsMPT 的northern blot 分析
• 5.1.2.5 不同处理条件下牡丹花芽内ATP 含量的测定
• 5.1.2.6 PsMPT 的超表达转基因研究
• 5.2 结果与分析
• 5.2.1 PsMPT 基因cDNA 全长的克隆
• 5.2.2 PsMPT 编码的蛋白质的生物信息学分析
• 5.2.2.1 同源性比较
• 5.2.2.2 功能结构域分析
• 5.2.2.3 跨膜结构域分析
• 5.2.2.4 信号肽分析
• 5.2.2.5 系统进化树分析
• 5.2.3 PsMPT 的亚细胞定位
• 5.2.4 不同处理条件下PsMPT 的表达模式变化
• 5.2.5 不同处理条件下牡丹花芽内ATP 的含量变化
• 5.2.6 PsMPT 超表达植株的表型分析
• 5.3 讨论
• 5.3.1 PsMPT 编码的蛋白质结构分析
• 5.3.2 PsMPT 编码的蛋白质功能分析
• 6 结论及研究展望
• 6.1 结论
• 6.2 研究展望
• 参考文献
• 作者简介
• 导师简介
• 博士期间发表的论文
• 致谢