小鼠囊胚发育阶段miRNA表达的研究

论文摘要

miRNA是指长度为21-25个核苷酸的小型非编码RNA家族,由70-90 nt的可形成发夹状结构的内源性转录前体加工而成1。miRNA通过与靶标mRNA的3’UTR区进行完全或不完全互补配对结合,抑制mRNA的翻译或直接使mRNA降解,在转录后水平调控基因的表达2。miRNA家族的成员在研究秀丽线虫的发育转变过程中作为小分子短暂RNA（stRNA）被发现的。研究发现miRNA是stRNA中的一个大家族,并且很容易在线虫、苍蝇、植物、哺乳动物中找到。miRNA的功能并不局限于发育调节,它有着不同的表现形式,还可能控制着生长发育和生理机能的很多方面。miRNA的广泛存在与进化保守性,暗示着它在生命活动中具有必不可少的调节作用,对基因表达、生长发育和行为等都具有十分广泛和深远的效应。大量文献研究显示miRNA作为基因表达调控中的一个重要分子,与哺乳动物的发育密切相关;研究在特定组织和特定发育阶段的miRNA表达意义重大。本课题采用miRNA芯片和RT-PCR的方法,研究小鼠囊胚发育阶段miRNA表达谱,为进一步深入研究miRNA在着床前胚胎发育过程中的表达和功能奠定基础。目的:研究小鼠囊胚发育阶段miRNA的表达谱,探讨miRNA在着床前胚胎发育中的作用和意义。方法:1.运用腹腔注射孕马血清及人绒毛膜促性腺激素诱导超排卵的方法收集小鼠囊胚。2.采用miRNA芯片技术筛查小鼠囊胚发育阶段miRNA的表达谱。3.RT-PCR方法验证芯片得到的小鼠囊胚发育阶段miRNA表达的结果。结果:1.共收集小鼠囊胚6000多个,获取Total RNA总量5μg;取2μg Total RNA用于miRNA芯片杂交。用miRNA芯片技术,以芯片上荧光背景值2倍以上即荧光值大于600作为筛查标准,在小鼠囊胚发育阶段共筛查到124个miRNA,其中有81个miRNA是在小鼠的着床后胚胎组织发现的,其中包括现已证实与发育和细胞分化相关的miRNA let-7e、miR-125a和miR-181a。另有43个miRNA是目前通过生物信息学分析预测其可能存在于小鼠中但尚未得到确认。2.采用RT-PCR方法进一步确认let-7e和miR-125a（与线虫lin 4同源）在囊胚中的表达,取RT-PCR产物5μl经12%聚丙烯酰胺凝胶电泳,let-7e和miR-125a特异扩增产物、阳性对照人心脏miR-24扩增产物及内参照U6的扩增产物大小均在90 bp左右;阴性对照为无RT产物有PCR引物,电泳可见有60-70 bp引物二聚体条带结果。根据电泳结果表明let-7e和miR-125a均在囊胚表达,与芯片结果一致。结论:研究发现miRNA在动物着床后胚胎发育的各个阶段都有表达,并可能对胚胎发育有影响,但现在关于miRNA在着床前胚胎中的表达及其功能文献报道还很少。本实验采用miRNA芯片技术,大规模、高通量、快速而有效检测miRNA表达谱,并结合灵敏度较高的RT-PCR方法,发现在小鼠囊胚发育阶段表达大量的miRNA。其中包括了几个重要的现已证实与胚胎发育和细胞分化有关的miRNA,其可能对着床前胚胎发育和分化过程起重要的调控作用。为进一步深入研究miRNA在着床前胚胎表达和功能奠定了基础并提供了重要的实验依据。

论文目录

• 缩略语表
• 中文摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 文献回顾
• 一、 miRNA简介
• 二、miRNA的研究方法
• 三、 miRNA在动物胚胎发育方面的研究进展
• 四、目前研究存在的问题
• 正文
• 1 材料
• 2 方法
• 3 结果
• 3.1 对囊胚样品的总RNA进行定量和定性检测的结果
• 3.2 基因芯片筛查小鼠囊胚miRNA表达的结果
• 3.3 RT-PCR验证芯片表达miRNA的结果
• 4 讨论
• 小结
• 参考文献
• 个人简历
• 就读研究生期间发表的文章
• 致谢