论文摘要
目的:筛选本课题组前期对Gcn5（组蛋白乙酰基转移酶辅激酶）基因设计的7条质粒片段中能高效抑制Gcn5表达的shRNA序列;探讨干扰Gcn5表达后是否能够引起体内组蛋白乙酰化修饰平衡的改变;观测下调组蛋白乙酰化修饰状态对体内、外MSCs（骨髓间充质干细胞）定向分化为心肌细胞的影响,从而探讨组蛋白低乙酰化状态对MSCs定向分化的调控机理;建立通过干预组蛋白乙酰化平衡状态来调节MSCs定向分化的“基因调节开关”的理论与实验技术平台。方法:采用不同组合质粒片段干扰体外培养的MSCs,通过观察细胞形态变化,ELISA技术检测MSCs细胞核蛋白HAT（组蛋白乙酰化酶）活性状态,Western-blotting分析MSCs细胞核Gcn5蛋白表达,荧光显微镜观察质粒转染细胞荧光表达量,流式细胞技术检测质粒转染效率,筛选有效质粒片段;利用筛选出的有效shRNA转染MSCs,通过ELISA技术检测MSCs细胞核HAT活性状态,验证通过沉默Gcn5基因是否能够下调组蛋白乙酰化修饰水平。利用shRNA-ZJ3转染单纯MSCs或经5-aza（5-氮杂胞苷）处理前后的MSCs,通过观察细胞形态变化, CHIP技术分析乙酰化的组蛋白H3肽链上的相关基因（Gcn5;GATA-4）表达,透射电镜观测细胞超微结构的变化,分析下调组蛋白乙酰化修饰状态是否能够干预MSCs体外特化心肌细胞的过程;移植经有效shRNA转染的MSCs至大鼠心肌组织,2W后检测移植区心肌组织中HAT活性状态,Gcn5、GATA-4基因及Gcn5、MHC、Cx43蛋白的表达状况,探讨心肌微环境中组蛋白乙酰化修饰对MSCs特化心肌细胞的调控机理。结果:1、观察各种质粒转染的MSCs形态变化显示经shRNA-ZJ3经各种预处理的MSCs较正常MSCs形态变化最大,生长比较缓慢;shRNA-ZJ3转染的MSCs细胞核HAT活性及Gcn5蛋白表达量均明显降低（P<0.05）;荧光显微镜观察GFP表达量及流式细胞技术检测显示转染效率大于20%。2、经shRNA-ZJ3转染的MSCs细胞核内HAT活性较正常MSCs及shRNA-HK（通用阴性质粒对照）转染的MSCs明显降低（P<0.05）。3、5-aza诱导的MSCs细胞生长旺盛,单纯shRNA-ZJ3转染或5-aza诱导前后经shRNA-ZJ3转染的MSCs生长迟滞,形态瘦小;细胞核蛋白HAT测定显示:5-aza诱导组乙酰化水平最高,单纯转染组（TR组）、诱导后转染组（IN-TR组）以及转染后诱导组（TR-IN组）与正常组比较HAT活性均有显著性降低（P<0.05）,TR组分别与Normal组、HK组及IN组比较HAT活性降低亦有显著性（P<0.05）;经5-aza诱导后的MSCs（阳性对照组）与高乙酰化水平组蛋白H3相交联的Gcn5及GATA-4表达较正常组（正常培养MSCs组）、阴性对照组（HK转染组）及实验组（5-aza诱导后shRNA-ZJ3转染组）均有显著性增高（P<0.05）;实验组中与高乙酰化水平组蛋白H3相交联的Gcn5表达较正常对照组、阴性对照组及阳性对照组均有显著性的降低（P<0.05）;电镜检测细胞超微结构发现经5-aza诱导的MSCs增生活跃,外形长条化,胞浆出现肌丝结构,shRNA-ZJ3转染的MSCs细胞核中异染色质比例增大,部分细胞出现凋亡。4、体内移植区心肌组织内HAT活性检测发现实验组（shRNA-ZJ3转染MSCs移植组）乙酰化酶活性较正常组（正常心肌组织）、阴性对照组1（shRNA-HK转染组）及阴性对照组2（DAPI标记MSCs移植组）均有显著性降低（P<0.05）;实验组中可检测到Gcn5及GATA-4基因的低表达,较其它三个对照组表达量均有显著性降低（P<0.05）。结论:1、前期课题组构建的7条质粒片段中shRNA-ZJ3能够有效干预Gcn5基因的表达。2、shRNA-ZJ3阻断Gcn5基因表达后能够下调细胞核组蛋白乙酰化修饰水平,导致组蛋白乙酰化失衡状态的出现。3、组蛋白乙酰化修饰平衡参与调控MSCs体外特化心肌细胞的过程。4、心肌微环境中MSCs的组蛋白乙酰化活性状态与分化活性及分化启动密切相关。5、组蛋白乙酰化修饰参与调节MSCs在体内心肌微环境中特化为心肌细胞的过程。低组蛋白乙酰化修饰导致的静默状态的MSCs无法进入定向分化进程。6、成功建立通过干预组蛋白乙酰化平衡调节MSCs定向分化的“基因调控开关”的理论与实验技术平台。
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