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IBV与IBDV二联核酸疫苗构建及与鸡IL-18共同免疫效力研究

2020-12-15阅读(548)

IBV与IBDV二联核酸疫苗构建及与鸡IL-18共同免疫效力研究

论文摘要

本研究首先对IBV S1、IBDV VP2基因进行亚克隆,并利用一段linker将IBV S1、IBDV VP2基因连接后,利用真核表达载体pVAX-1,通过基因重组分别构建真核重组表达质粒pVAX-IBV S1、pVAX-IBDV VP2和pVAX-IBV S1-linker-IBDV VP2。体外瞬时转染实验表明,外源基因能够在细胞内进行表达,并且表达后的蛋白可以被相应的IBV S1多克隆抗体和IBDV VP2多克隆抗体识别,说明了插入的外源基因具备各自的免疫反应性,为动物体内试验提供了基础。将试验鸡分为8组,即S1组（免疫pVAX-IBV S1真核重组质粒）、VP2组（免疫pVAX-IBDV VP2真核重组质粒）、SV组（免疫pVAX-IBV S1-linker-IBDV VP2真核重组质粒）、SV18组（免疫pVAX-IBV S1真核重组质粒和pVAX-ChIL-18真核重组质粒）、18组（免疫pVAX-ChIL-18真核重组质粒）、YM组（免疫IBVH120疫苗和IBDV疫苗）、PBS组（免疫PBS）、pVAX组（免疫pVAX空载体质粒）。免疫过程中利用淋巴细胞增殖试验、酶联免疫吸附试验、中和抗体试验以及利用流式细胞术检测CD4+、CD8+T淋巴细胞动态变化,对不同日龄的试验动物进行检测,最后用病毒攻击试验比较免疫不同质粒组别之间保护率。实验结果表明,二联核酸疫苗对两种病毒的攻击有一定的保护作用,添加了ChIL-18作为免疫佐剂增强了二联核酸疫苗的免疫效果,同时增加了核酸疫苗对病毒攻击的保护力。

论文目录

  • 中文摘要
  • 英文摘要
  • 1 前言
  • 1.1 鸡传染性支气管炎研究进展
  • 1.1.1 IBV 的生物学分类地位
  • 1.1.2 IBV 粒子结构
  • 1.1.3 IBV 结构蛋白及其生物学功能
  • 1.1.4 IBV 理化特性
  • 1.1.5 IBV 疫苗研究进展
  • 1.2 鸡传染性法氏囊研究进展
  • 1.2.1 IBDV 生物学分类
  • 1.2.2 IBDV 粒子结构
  • 1.2.3 IBDV 的结构蛋白及生物学功能
  • 1.2.4 IBDV 理化特性
  • 1.2.5 IBDV 疫苗研究进展
  • 1.3 鸡白细胞介素（INTERLEUKIN）研究进展
  • 1.3.1 鸡白介素1（ChIL-1）
  • 1.3.2 鸡白介素2（ChIL-2）
  • 1.3.3 鸡白介素6（ChIL-6）
  • 1.3.4 鸡白介素15（ChIL-15）
  • 1.3.5 鸡白介素18（ChIL-18）
  • 1.4 研究的目的与意义
  • 2 材料与方法
  • 2.1 试验材料
  • 2.1.1 病毒株
  • 2.1.2 试验动物
  • 2.1.3 细胞株、菌株、载体及质粒
  • 2.1.4 主要工具酶、抗体及分子生物学试剂盒
  • 2.1.5 主要生化试剂
  • 2.1.6 主要实验仪器设备
  • 2.2 试验方法
  • 2.2.1 IBV S1 基因、IBDV VP2 基因的亚克隆及其真核表达质粒的构建
  • 2.2.2 IBV S1、IBDV VP2 融合基因真核表达质粒的构建
  • 2.2.3 抗IBDV VP2 蛋白多克隆抗体的制备和鉴定
  • 2.2.4 pVAX-IBV S1、pVAX-IBDV VP2、pVAX-IBV S1-linker-IBDV VP2 重组质粒体外瞬时表达及其表达产物的检测
  • 2.2.5 pVAX-IBV S1、pVAX-IBDV VP2 重组质粒稳定表达细胞系的建立和鉴定
  • 2.2.6 实验动物分组、免疫及各组免疫效果的检测
  • 2.3 数据处理
  • 3 试验结果
  • 3.1 IBV S1 基因、IBDV VP2 基因的亚克隆及其真核表达质粒的构建及鉴定
  • 3.1.1 pVAX-IBV S1 重组质粒的构建及鉴定
  • 3.1.2 pVAX-IBDV VP2 重组质粒的构建与鉴定
  • 3.2 PVAX-IBV S1-IBDV VP2 重组质粒的构建与鉴定
  • 3.2.1 IBV S1、IBDV VP2 片断的亚克隆
  • 3.2.2 pVAX-IBV S1-IBDV VP2 重组质粒的PCR 及双酶切鉴定
  • 3.2.3 pVAX-IBV S1-IBDV VP2 重组质粒的测序鉴定
  • 3.3 抗IBDV VP2 蛋白多克隆抗体的制备及鉴定
  • 3.3.1 pGEX-IBDV VP2 原核表达质粒的单双酶切鉴定
  • 3.3.2 间接酶联免疫吸附试验（ELISA）检测多抗效价
  • 3.3.3 western blot 检测多抗特异性
  • 3.4 PVAX-IBV S1、PVAX-IBDV VP2、PVAX-IBV S1-LINKER-IBDV VP2 重组质粒体外瞬时表达及其表达产物的检测
  • 3.4.1 pVAX-IBV S1 真核表达质粒体外转染及其检测
  • 3.4.2 pVAX-IBDV VP2 真核表达质粒体外转染及其检测
  • 3.4.3 pVAX-IBV S1-linker-IBDV VP2 真核表达质粒体外转染及其检测
  • 3.5 PVAX-IBV S1、PVAX-IBDV VP2 重组质粒稳定表达细胞系的建立
  • 3.5.1 RT-PCR 方法检测pVAX-IBV S1、pVAX-IBDV VP2 基因的表达
  • 3.5.2 间接免疫荧光检测pVAX-IBV S1、pVAX-IBDV VP2 重组质粒在两种稳定表达细胞系中的表达
  • 3.6 雏鸡外周血及免疫器官T、B 淋巴细胞增殖的动态变化
  • 3.6.1 雏鸡血液T 淋巴细胞增殖的动态变化
  • 3.6.2 雏鸡血液B 淋巴细胞增殖的动态变化
  • 3.6.3 雏鸡胸腺T 淋巴细胞增殖的动态变化
  • 3.6.4 雏鸡脾脏T 淋巴细胞增殖的动态变化
  • 3.6.5 雏鸡脾脏B 淋巴细胞增殖的动态变化
  • 3.7 雏鸡外周血及免疫器官CD4+、CD8+T 淋巴细胞动态变化
  • 3.7.1 雏鸡外周血及免疫器官CD4+T 淋巴细胞动态变化
  • 3.7.2 雏鸡外周血及免疫器官CD8+T 淋巴细胞动态变化
  • 3.8 雏鸡外周血抗IBV、IBDV 抗体含量动态变化
  • 3.8.1 雏鸡外周血抗IBV 抗体含量动态变化
  • 3.8.2 雏鸡外周血抗IBDV 抗体含量动态变化
  • 3.9 各组雏鸡细胞毒性T 淋巴细胞的检测
  • 3.9.1 各组雏鸡细胞毒性T 淋巴细胞（CTL）杀伤分泌IBVS1 靶细胞的检测
  • 3.9.2 各组雏鸡细胞毒性T 淋巴细胞杀伤分泌IBDV VP2 靶细胞的检测
  • 3.10 中和抗体
  • 3.11 攻毒后雏鸡病变的观察结果
  • 3.12 保护率计算结果
  • 4 讨论
  • 4.1 融合基因真核载体表达质粒的设计与构建
  • 4.2 多克隆抗体的制备及其效价鉴定结果分析
  • 4.3 融合基因真核载体表达质粒体外瞬时转染鉴定结果及分析
  • 4.4 融合基因真核载体表达质粒体外稳定转染及CTL 活性测定
  • 4.5 雏鸡进行核酸免疫的讨论与分析
  • 4.6 雏鸡免疫后淋巴细胞增殖功能变化结果分析
  • 4.6.1 雏鸡免疫后血液及免疫器官T 淋巴细胞增殖活性分析
  • 4.6.2 雏鸡免疫后血液及免疫器官B 淋巴细胞增殖活性分析
  • 4.7 雏鸡免疫后不同亚型T 细胞动态变化结果分析
  • +T 细胞动态变化结果分析'>4.7.1 雏鸡免疫后免疫器官及血液CD4+T 细胞动态变化结果分析
  • +T 细胞动态变化结果分析'>4.7.2 雏鸡免疫后免疫器官及血液CD8+T 细胞动态变化结果分析
  • 4.8 外周血液抗IBV 和IBDV IGG 抗体含量动态变化结果分析
  • 4.9 病毒攻击试验雏鸡后病理学观察结果、感染率及保护率计算结果的讨论与分析
  • 4.10 免疫效果比较分析
  • 5 结论
  • 致谢
  • 参考文献
  • 攻读硕士学位期间发表的学术论文

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