玉米PAB5基因启动子的克隆与功能分析

论文摘要

启动子是直接调控基因特异性表达的重要元件，它驱动基因的表达决定了基因表达的强度、时间和空间等特异性。组织特异启动子作为一类专一性启动子，能指导外源基因在植物发育过程中某一特定时空表达，它能使目的基因的表达产物在一定空间积累，增加区域表达量，避免了植物营养的浪费。因此，寻找专一性启动子，使外源基因特异、高效的表达已成为植物基因工程的关键环节。花粉特异性启动子可以通过驱动能干扰花粉产生或生存能力的基因而导致雄性不育，或在花粉粒中特异性表达目的基因，所以研究玉米的花粉特异性启动子具有一定的意义。本研究构建了ZMP5启动子的5个水稻缺失转化载体，然后通过农杆菌转化法将构建的载体转入水稻中，对获得的再生植株进行PCR鉴定和GUS染色分析，具体研究结果如下：（1）根据文献中已发表的拟南芥PAB5基因的蛋白序列，经过蛋白比对获得玉米的PAB5基因的蛋白序列，获得该基因的DNA序列。（2）用PLACE数据库对分离的序列进行元件分析后发现，该序列除含有TATA-box、CAAT-box等启动子具有的一般元件外，还含有与花粉特异性表达相关的元件:AGAAA元件（3个）和PolyA-S3元件（1个），推测其可能是花粉特异性启动子。（3）为了验证ZMP5启动子的调控特性，对ZMP5启动子进行了5′端缺失分析,与GUS基因融合构建了5个5‘端缺失载体，分别命名为pCam-ZMP5p、 p1706、p1198、p777和p365。（4）分别的植物表达载体ZMP5p通过农杆菌转化技术，获得了转基因植株。对转基因植株PCR检测，得到阳性植株，转化率达到71.4%以上。GUS组织检测，证明ZMP5启动子可驱动GUS基因在水稻的花粉中表达，在其他组织中不表达。本文分离的玉米PAB5花粉特异性启动子是首次报道，研究得到的启动子资源可以有效地在植物的转基因育种中加以利用，更有效、更有针对性地表达外源基因，解决转基因育种中的安全性问题，可以在转基因育种得到应用。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 目录
• 1. 文献综述
• 1.1 启动子的结构
• 1.1.1 转录起始位点
• 1.1.2 核心启动子区
• 1.2 植物启动子的分类及应用
• 1.2.1 组成型启动子
• 1.2.2 组织特异性启动子
• 1.2.3 诱导型启动子
• 1.3 启动子的分离方法
• 1.3.1 常规 PCR 技术
• 1.3.2 反向 PCR
• 1.3.3 TAIL-PCR
• 1.4 启动子顺式作用元件的生物信息学分析
• 1.4.1 PLACE（Plant Cis-acting Regulatory DNA Element）
• 1.4.2 PlantCARE（Plant Cis-Acting Regulatory Elements）
• 1.4.3 其他启动子顺式作用元件分析资源
• 1.5 启动子检测中使用的报告基因
• 1.5.1 GUS 基因
• 1.5.2 GFP 基因
• 1.6 本课题研究背景和研究内容
• 1.6.1 本课题的研究背景
• 1.6.2 本课题的研究内容
• 2. PAB5 基因启动子的分析
• 2.1 材料和方法
• 2.1.1 实验材料
• 2.1.2 仪器设备
• 2.1.3 研究方法
• 2.2 数据库及数据查询
• 2.3 玉米花粉组织特异性表达的基因 PAB5 的获得
• 2.4 玉米花粉组织特异性启动子 ZMP5 的克隆
• 2.5 植物表达载体的构建
• 2.5.1 ZMP5p 植物表达载体的构建
• 2.5.2 不同长度的 ZMP5p 5’端缺失载体的构建
• 2.5.3 ZMP5p 及不同长度缺失载体的 PCR 鉴定
• 2.5.4 ZMP5p 及不同长度缺失载体的酶切鉴定
• 2.5.5 农杆菌介导法转化水稻
• 2.5.6 转基因水稻的的鉴定
• 3. 结果和分析
• 3.1 PAB5 基因启动子片段的克隆
• 3.2 ZMP5p 序列的分析
• 3.3 ZMP5p 缺失载体的 PCR 鉴定
• 3.4 ZMP5p 缺失载体的酶切鉴定
• 3.5 pCam-ZMP5p：：GUS 转基因植株的获得
• 3.6 pCam-ZMP5p：：GUS 转基因植株的检测
• 3.6.1 pCam-ZMP5p：：GUS 转基因植株的 PCR 检测
• 3.6.2 pCam-ZMP5p：：GUS 转基因植株的 GUS 组织特异性检测
• 4. 讨论
• 4.1 ZMP5p 片段的序列分析
• 4.2 pCam-ZMP5p：：GUS 在转基因植株中的组织特异性表达
• 5. 结论
• 参考文献
• 附录 水稻培养基配方
• 致谢
• 作者简介
• 攻读硕士学位期间研究成果