论文摘要
急性冠脉综合征（Acute Coronary Syndrome,ACS）,是一组由急性心肌缺血引起的临床综合征,病理基础为冠状动脉粥样硬化（artherosclerosis, As）斑块破裂或糜烂引起的继发完全或不完全闭塞性血栓形成的一组临床综合征。As不稳定斑块的破裂的原因复杂,但斑块的不稳定性与氧化应激特别是氧化低密度脂蛋白（oxidation low density lipoprotein,OX-LDL）和基质金属蛋白酶9（matrix metalloproteinase ,MMP-9）的活性密切相关。目的以载脂蛋白E基因缺陷小鼠（ApoE-/-）为As模型,通过观察何首乌总苷对ApoE基因缺陷小鼠体内氧化应激及As斑块蛋白表达的影响,重点研究何首乌总苷对实验性As斑块稳定性的影响,及对MMP-9的可能调控机制,从实验病理角度,探讨何首乌总苷可能的稳定As斑块的机制,为从稳定斑块角度对冠心病的治疗提供新思路和实验依据。方法以8周龄ApoE-/-小鼠为研究对象,0.15%胆固醇高脂饲料喂养16周复制动脉粥样硬化动物模型,24只随机分为模型组、何首乌总苷高（150mg·kg-1·d-1）、低剂量组（25mg·kg-1·d-1）、阳性药物对照组各6只,6只C57BL/6小鼠为阴性对照组。喂养16周后,行超声生物显微镜检查小鼠主动脉、颈动脉斑块形态及性质。眼眶取血并处死小鼠,分离主动脉,10%中性福尔马林固定。常规方法测定血脂、肝功、肾功。常规生化法测定血浆一氧化氮（nitro oxide, NO）、总抗氧化能力（total antioxidation capacity, TAC）、丙二醛（malondialdehyde, MDA）及血脂水平;采用主动脉根部连续石蜡切片、HE染色观察As斑块的形成和Masson染色观察斑块部位胶原含量的变化。免疫组化方法观察粥样斑块中巨噬细胞数量、平滑肌细胞数量、MMP-9、核转录因子NF-ΚB（nuclear factorΚB ）、金属蛋白酶组织抑制剂TIMP-1（tissue inhibitor of metalloproteinase）蛋白表达。结果1、As斑块动物模型复制实验第16周后,模型组ApoE-/-小鼠的肉眼病变最明显,其余各组ApoE-/-小鼠的主动脉内均可看到较明显的点状或斑片状隆起,多位于主动脉窦至主动脉弓血管分支处,其次为胸主动脉和腹主动脉。阴性对照组未看到有病变形成,内膜光滑,血管弹性好,不易断开。2、利用超声生物显微镜观察ApoE-/-小鼠动脉IMT和动脉斑块的形态发现各组apoE-/-小鼠主动脉内膜不光滑,IMT有不同程度增厚,但与阴性对照组没有显著统计学差异（P>0.05）;模型组、何首乌总苷高低剂量组均有明显斑块形成,以升主动脉最为显著,其中大部分斑块为稳定性硬斑块,可见钙化及声影。模型组有软斑块形成。阴性对照组没有观察到IMT增厚,动脉内膜光滑,未见有斑块病变。3、观察何首乌总苷对ApoE-/-小鼠血脂、氧化应激的影响何首乌总苷高、低剂量组与模型组之间血清总胆固醇（total cholesterol, TC）、甘油三酯（ triglyceride, TG ）、高密度脂蛋白-胆固醇（ high-densitylipoprotein-cholesterol, HDL-C）均无显著性差异（p>0.05）,同时,两治疗组之间也无显著性差异（p>0.05）,提示何首乌总苷在本实验中对小鼠血脂只有轻度的降低作用。与模型组比较,何首乌总苷高、低剂量治疗组血浆中NO含量均显著升高（分别为:32.89±25.79 vs. 3.50±2.35;28.57±12.60vs. 3.50±2.35,均为p<0.01）、TAC明显增加（分别为:185.23±51.99 vs. 73.69±38.28;184.54±42.06 vs. 73.69±38.28,均为p<0.01）、MDA含量显著减低（分别为:12.83±2.25 vs. 45.47±5.34,p<0.01;12.63±3.21 vs. 45.47±5.34,p<0.05）。4、病理分析观察ApoE-/-小鼠斑块的形态和结构;阴性对照组小鼠血管内膜光滑,连续性好,中膜平滑肌细胞排列整齐,管壁厚薄均匀。而ApoE-/-小鼠主动脉切片HE染色后光镜下可见模型组ApoE-/-小鼠内膜显著增厚,均为成熟的粥样斑块,纤维帽较薄,纤维帽及斑块内部位可见大量泡沫细胞,有较大的脂质池;何首乌总苷低剂量组和阳性对照组均为粥样斑块;何首乌总苷高剂量组有2只形成纤维斑块,其余为粥样斑块,何首乌总苷高剂量组和阳性对照组斑块纤维帽较厚,有少量胆固醇结晶。在血管分支处也可以见到斑块。各组在管腔面积和斑块面积方面均无显著性差异（p>0.05）。5、Masson染色观察ApoE-/-小鼠斑块部位胶原含量的变化模型组斑块的胶原含量及占斑块的面积比值较何首乌总苷高、低剂量组、阳性对照组明显减少（P<0.05）,模型组斑块的平滑肌细胞（SMC）含量较何首乌总苷高、低剂量组、阳性对照组明显减少也明显减少。6、通过免疫组化染色的方法,观察何首乌总苷对ApoE-/-小鼠斑块部位CD68、α-SMA、NF-κB、MMP-9、TIMP-1蛋白表达的影响ApoE-/-小鼠主动脉粥样斑块的纤维帽及斑块脂质核心处均有不同数量的VSMCs和巨噬细胞,何首乌总苷高、低剂量组斑块中VSMCs阳性染色面积占斑块面积的百分比均较模型组显著增加（分别为:0.24±0.11 vs. 0.14±0.11;0.23±0.17 vs. 0.14±0.11,均为p<0.05）、巨噬细胞阳性染色面积占斑块面积的百分比均较模型组明显降低（p<0.01）;何首乌总苷高、低剂量组与阳性对照组皆可明显抑制或下调ApoE-/-小鼠主动脉斑块MMP-9表达（p<0.01）;实验组与模型组相比,何首乌总苷高、低剂量组与阳性对照组皆可明显增加或上调ApoE-/-小鼠主动脉斑块TIMP-1表达量（p<0.01）;与模型组比较,何首乌总苷高、低剂量组与阳性对照组皆可明显抑制或下调ApoE-/-小鼠主动脉斑块NF-κB表达（分别:p<0.01;p<0.01;p<0.05）。结论1.何首乌总苷具有明显的抗氧化作用,能显著降低MDA的含量、显著升高NO、总抗氧化能力。2.何首乌总苷能增加As斑块部位胶原含量。3.何首乌总苷能抑制As斑块部位CD68、MMP-9、NF-κB的表达,增加As斑块部位α-SMA、TIMP-1的表达。4.何首乌总苷具有稳定斑块的作用,机制可能是通过降脂、抗氧化,抑制氧化应激诱导的NF-κB的表达,从而抑制MMP-9的表达增加了TIMP-1的表达,减少细胞外基质的降解,增加斑块的胶原含量增强斑块纤维帽的抗破裂能力实现的。从而为中西医结合防治冠心病提供新的思路和实验依据。