小麦面筋多肽的分离纯化及抗氧化活性测定

论文摘要

小麦面筋蛋白是小麦淀粉生产过程中的副产品,由于在水中溶解性差,限制了在食品中的应用,为提高其溶解性、增强其附加值和拓宽其应用范围,本文采用酶法水解小麦蛋白,得到具有生物活性的小麦活性多肽。在前期研究的基础上,主要研究了双酶法协同水解小麦面筋蛋白获得最大抗氧化活性的相关条件,通过多种分离纯化手段获得组分相对单一的抗氧化多肽,并对其体外抗氧化活性进行系统分析,最终对其结构特征以及氨基酸序列进行鉴定。主要结论如下：1)首先,在前期研究的基础上,以水解度和抗氧化活性为指标,考察碱性蛋白酶、酸性蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、胰蛋白酶以及小麦水解专用酶分别与中性蛋白酶组合水解小麦面筋蛋白的效果。结果显示中性蛋白酶与胰蛋白酶组合抗氧化活性最强。通过研究两种酶的添加比例、温度、pH、底物浓度、加酶量以及反应时间等因素对水解产物DPPH自由基清除率的影响,得到最佳的酶解工艺条件为：中性蛋白酶/胰蛋白酶=2/1、小麦面筋蛋白浓度9%、加酶量为0.07、pH为9、温度为50℃、水解时间为1.5h、DPPH清除率可达到92.87%。2)其次,在最佳酶解条件得到小麦蛋白水解液,采用不同截留分子量（10000、5000、3000Da）的超滤膜对小麦面筋蛋白酶解产物进行初步分离,获得D-WG（酶解原液）、D-WG-10 （>10000Da）、D-WG-5 （5000～10000Da）、D-WG-3 （3000～5000Da）和D-WG-0 （<3000Da）等5种不同分子量组分。比较以上各肽段的抗氧化活性（DPPH自由基清除率,对O2-抑制活性,对羟自由基的抑制活性,还原力）得到D-WG-0的肽段具有最强的抗氧化活性。进而采用Sephadex G-25和DEAE-Sepharose FF进一步纯化,得到组分相对单一的多肽D-WG-0-Ⅰ。RP-HPLC对该组分纯度进行鉴定发现纯度为84%。3)最后,考察D-WG-0-Ⅰ对小鼠肝组织MDA生成量、小鼠肝线粒体肿胀以及红细胞氧化溶血的影响,进一步研究了D-WG-0-1的抗氧化活性,结果显示D-WG-0-1具有作为抗氧化剂的潜质。并采用紫外光谱、红外光谱以及MALDI-TOF/TOF-MS等手段对D-WG-0-Ⅰ结构进行了系统分析,确定出其氨基酸序列为Ser-Gly-Ala-Asp-Lys-Lys-pro-Ile-Lys-Ala-Asn-His。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第1章 绪论
• 1.1 功能性多肽
• 1.1.1 总论
• 1.1.2 几种功能性多肽
• 1.1.3 多肽的分离纯化方法
• 1.2 多肽的结构鉴定
• 1.2.1 紫外光谱分析
• 1.2.2 外光谱分析
• 1.2.3 核磁共振（NMR）
• 1.2.4 质谱分析
• 1.3 小麦面筋蛋白
• 1.3.1 小麦面筋蛋白的研究历史和现状
• 1.3.2 小麦面筋蛋白的改性
• 1.3.3 小麦面筋蛋白酶法水解多肽研究进展
• 1.4 立题的背景及意义
• 1.5 论文主要内容
• 第2章 不同蛋白酶组合酶解体系高效降解小麦面筋蛋白制备抗氧化活性肽的研究
• 2.1 前言
• 2.2 材料和仪器
• 2.2.1 实验材料
• 2.2.2 主要仪器
• 2.3 实验方法
• 2.3.1 小麦面筋蛋白的酶解
• 2.3.2 DPPH自由基清除活性的测定
• 3+还原力的测定'>2.3.3 Fe³⁺还原力的测定
• 2.3.4 小麦面筋蛋白水解度的测定
• 2.3.5 正交试验
• 2.3.6 数据处理
• 2.4 实验结果
• 2.4.1 最佳复合蛋白酶体系的选择
• 2.4.2 单因素实验
• 2.4.3 正交试验
• 2.5 讨论
• 2.6 本章小结
• 第3章 超滤法分离小麦面筋蛋白酶解活性多肽
• 3.1 引言
• 3.2 实验材料和仪器
• 3.2.1 实验材料
• 3.2.2 实验仪器
• 3.3 实验方法
• 3.3.1 超滤
• 3.3.2 不同分子量多肽组分的DPPH自由基清除活性
• 50)'>3.3.3 半清除率的测定(IC₅₀)
• 3.3.4 不同分子量多肽组分的还原力的测定
• 3.3.5 不同分子量多肽组分对羟自由基抑制活性的测定
• 2^-抑制活性的测定'>3.3.6 不同分子量多肽组分对超氧阴离子O₂^-抑制活性的测定
• 3.3.7 数据分析
• 3.4 实验结果
• 3.4.1 不同分子量多肽组分DPPH清除率的比较
• 3.4.2 不同分子量多肽组分的还原力比较
• 3.4.3 不同分子量多肽组分的对羟自由基抑制活性
• 2^-抑制活性的测定'>3.4.4 不同分子量多肽组分的对超氧阴离子O₂^-抑制活性的测定
• 3.4.5 D-WG-0氨基酸组成分析
• 3.5 讨论
• 3.6 本章小结
• 第4章 小麦活性多肽D-WG-0纯化及其体外抗氧化功能研究
• 4.1 引言
• 4.2 实验材料与仪器
• 4.2.1 实验材料与试剂
• 4.2.2 实验仪器
• 4.3 实验方法
• 4.3.1 小麦多肽组分D-WG-0的进一步纯化
• 4.3.2 体外抗氧化活性实验
• 4.3.3 数据分析
• 4.4 结果与分析
• 4.4.1 小麦多肽组分D-WG-0进一步纯化与鉴定
• 4.4.2 体外抗氧化性试验
• 4.5 讨论
• 4.6 本章小结
• 第5章 小麦活性多肽D-WG-0-Ⅰ的结构分析及鉴定
• 5.1 引言
• 5.2 实验材料和仪器
• 5.2.1 实验材料
• 5.2.2 实验仪器
• 5.3 实验方法
• 5.3.1 D-WH-0-1的紫外光谱分析
• 5.3.2 D-WH-0-1的红外光谱分析
• 5.3.3 氨基酸序列分析
• 5.4 实验结果与讨论
• 5.4.1 紫外光谱分析
• 5.4.2 红外光谱分析
• 5.4.3 MALDI-TOF-MS法
• 5.4.4 氨基酸序列的测定及分析
• 5.5 本章小结
• 主要结论
• 问题与展望
• 参考文献
• 致谢
• 硕士研究生期间发表的论文