脊髓损伤细胞凋亡机制研究及RNAi对Caspase-3基因表达的抑制作用

论文摘要

脊髓损伤（Spinal Cord Injury,SCI）的治疗是世界医学界一大难题。目前,脊髓损伤的基础研究主要集中在损伤后脊髓内继发性病理损伤的预防和逆转,阻止神经元和胶质细胞的死亡是脊髓损伤早期治疗最重要的目标。脊髓损伤后,神经细胞和组织发生坏死和凋亡。细胞凋亡是一个复杂的病理生理过程,凋亡调控的机理十分复杂,它由于脊髓损伤后细胞外液兴奋性氨基酸、氧自由基、一氧化氮、各种细胞因子和化学因子的释放,诱导细胞膜表面的死亡受体,如TNFRl,FAS/FASL,DR3,DR4,DR6等,触发死亡受体胞内结构域产生死亡信号,形成死亡信号复合体（DISC）,活化不同的ICE样蛋白酶,主要有Caspase家族成员介导的蛋白酶级联反应完成,使DNA降解,从而诱导凋亡。其中Caspase-3起着关键作用。Caspase-3能剪切和活化Caspase-6,Caspase-7,Caspase-9。其本身又受Caspase-8,Caspase-9,Caspase-10的剪切活化。’RNA干扰（RNA interference,RNAi）是近年来发展起来的一种封闭基因表达的方法。它是由双链RNA（double stranded RNA,dsRNA）诱导的序列性基因沉默,介导序列特异性的mRNA降解,是真核生物中一种非常保守的机制,能在细胞内有效地抑制有互补序列内源性基因的表达。RNA干扰自然存在于植物、真菌、果蝇等生物中。RNA干扰技术具有特异性和高效率,是基因功能研究和蛋白组学的有效工具,为药物靶基因的筛选,预防和治疗肿瘤、病毒感染等疾病提供了新的思路。本研究设计并合成了针对Caspase-3基因的siRNA,研究其阻断Caspase-3基因表达的效果,以期利用RNAi效应抗Caspase-3的表达和活性,’为抑制细胞凋亡的研究奠定基础。并探讨Caspase-3在神经元细胞凋亡的作用和影响,以及和Fas凋亡因子的关系,期望为抑制神经细胞凋亡,治疗脊髓损伤提供一种新的策略。本课题主要研究内容包括四个部分:1.大鼠脊髓损伤后细胞凋亡和Caspase-3、Fas的表达、变化规律,及与凋亡的关系。2.应用β-七叶皂甙钠治疗大鼠脊髓损伤后功能恢复、神经细胞凋亡表达的实验研究。3.非生物性多肽caspase-3抑制剂Z-DEVD-fmk对脊髓损伤细胞凋亡的影响和对神经功能恢复作用。4.RNAi对Caspase-3基因表达的抑制作用。用RNAi技术设计并合成特异性抑制Caspase-3的SiRNA:Si-Caspase-3,为探索基因治疗脊髓损伤奠定基础。第一部分大鼠脊髓损伤后细胞凋亡及Caspase-3、Fas的表达和意义[目的]:研究脊髓损伤后神经细胞凋亡表达及Caspase-3、Fas的表达变化规律。[方法]:使用改良Allen法制作大鼠急性SCI模型,实验分对照组（脊髓未受打击）和损伤5个组,致大鼠脊髓（T9、10）中度撞击损伤,损伤后6h、1d、3d、7d、15d取材,共分6组,采用HE染色、荧光Hoechst33258染色、原位末端脱氧核糖核酸转移酶介导DUTP标记法（TUNEL）对损伤脊髓组织进行标记;免疫组化方法测Caspase-3及凋亡因子Fas,半定量逆转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）测定各时间段Caspase-3的表达变化。[结果]:大鼠急性损伤后TUNEL标记阳性凋亡细胞6h开始出现,多位于脊髓白质;3d达到高峰,在灰质和白质均有表达,7d后开始降低,持续15d;免疫组化检测Fas表达的阳性细胞6h开始增高,2d达到高峰,15d下降;Caspase-3 mRNA 6h开始增高,3d达到高峰,7d后恢复正常。免疫组化检测Caspase-3表达的阳性细胞与TUNEL标记阳性凋亡细胞出现的时限相似。[结论]:脊髓损伤后存在神经细胞凋亡现象发生,Caspase-3参与了脊髓损伤细胞凋亡的调节。Caspase-3的表达和Fas的变化有一定的相关性。第二部分β-七叶皂甙钠治疗大鼠脊髓损伤的实验研究[目的]:观察β-七叶皂甙钠治疗大鼠脊髓损伤后神经功能恢复、损伤段神经细胞凋亡表达情况。[方法]:22只SD大鼠根据损伤及治疗情况分为3组:空白组、损伤组、治疗组,观察药物治疗前后大鼠的神经功能行为的变化。损伤后12天处死动物,损伤段脊髓标本做组织学切片,HE染色;做免疫组化检测凋亡因子（包括bcl-2,bax,fas）及Caspase-3的表达;TUNEL标记凋亡细胞;比较各组间差别。[结果]:治疗组在用药后,神经功能有所提高,且与损伤组比较,效果显著（P<0.05）。凋亡指标检测:fas、bax、Caspase-3、TUNEL显示,损伤组的凋亡阳性细胞明显多于治疗组:bcl-2显示,治疗组的阳性表达明显多于损伤组（P<0.05）。[结论]:β-七叶皂甙钠能抑制脊髓神经细胞凋亡,对损伤脊髓的神经功能具有保护作用。第三部分Caspase-3抑制剂Z-DEVD-FMK对大鼠脊髓损伤后细胞凋亡的作用[目的]:观察Caspase-3抑制剂Z-DEVD-FMK对大鼠脊髓损伤后细胞凋亡的影响。[方法]:将36只SD大鼠以改良Allen法制作大鼠急性SCI模型（脊髓中度损伤）,分为对照组（单纯损伤A组18只,按时间段又分为A1,A2,A3）,治疗组（应用Z-DEVD-FMK治疗B组18只,按时间段又分为B1,B2,B3）。损伤后6h,3d,8d对脊髓损伤区进行组织学HE染色,细胞凋亡TUNEL标记,Fas凋亡因子检测,免疫组化检测Caspase-3的表达变化,同时采用BBB评分方法和斜板试验观察神经功能恢复情况。[结果]:对照组和治疗组均见TUNEL阳性的凋亡细胞和Caspase-3表达。Z-DEVD-FMK治疗组神经细胞的凋亡数减少,Caspase-3表达降低,神经功能增强,两组相比差异有显著性（P<0.05）。[结论]:Caspase-3抑制剂Z-DEVD-FMK能减少继发性脊髓损伤细胞凋亡和促进神经功能的恢复。第四部分RNAi对Caspase-3基因表达的抑制作用[目的]:研究RNAi（RNA interference）效应对Caspase-3基因表达的抑制作用,为脊髓损伤的基因治疗奠定基础。[方法]:根据Caspase-3基因序列及其二级结构特征,设计3条含21个碱基的siRNA（Si-Caspase-3-1,Si-Caspase-3-2,Si-Caspase-3-3）,确定并合成了针对Caspase-3基因的siRNA;利用脂质体介导方法将合成的siRNA转染神经胶质细胞,以未转染的细胞为对照;细胞爬片后,用荧光Hoechst33258染色,TUNEL法观察凋亡细胞,应用半定量RT-PCR法和Western blot检测Caspase-3蛋白酶活性,验证siRNA的抑制效果。[结果]:合成的siRNAs可以抑制Caspase-3基因的表达,Si-Caspase-3-3在神经胶质细胞内对Caspase-3 mRNA表达的抑制效率为86.32%。[结论]:在细胞水平上,合成的siRNAs可以抑制Caspase-3基因的表达,为利用RNAi抑制Caspase-3的活性和表达的研究奠定基础,为探讨Caspase-3在细胞凋亡途径中的作用提供了一种工具,期望为治疗凋亡相关疾病提供一种新的策略。

论文目录

• 一.英文缩写词对照表
• 二.摘要
• 中文摘要
• 英文摘要
• 三.正文
• 前言
• 第一部分 大鼠脊髓损伤后细胞凋亡及Caspase-3、Fas的表达和意义
• 1.材料和方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 参考文献
• 附图
• 第二部分 β-七叶皂甙钠治疗大鼠脊髓损伤的实验研究
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 参考文献
• 附图
• 第三部分 Caspase-3抑制剂Z-DEVD-FMK对大鼠脊髓损伤后细胞凋亡的作用
• 1.材料和方法
• 2.结果
• 3 讨论
• 参考文献
• 附图
• 第四部分 RNAi对Caspase-3基因表达的抑制作用
• 1 材料和方法
• 2.细胞培养及转染
• 3.结果
• 4.讨论
• 参考文献
• 附图
• 四.研究总结
• 五.综述
• 综述一 脊髓损伤细胞凋亡与调控机制
• 综述二 RNAi在基因治疗中研究进展
• 六.攻读博士学位期间发表论文题录
• 七.致谢