β-catenin在高氧致新生鼠BPD中的作用及其机制的研究

论文摘要

前言支气管肺发育不良（Bronchopulmonary dysplasia,BPD）是采用机械通气或氧气治疗早产儿严重心肺疾病后常见的并发症,是威胁早产儿健康和生命质量的首要疾病。随着围产医学的不断发展,极低出生体重儿的成活率明显提高,BPD的发病率也在不断上升,其病理特点由过去显著的肺间质纤维化转变为以肺泡发育阻滞为突出特征。BPD的发病机理包括:肺脏发育极不成熟,外界损伤以及损伤后修复机制的破坏。故此,BPD的发生可简单理解为在正常肺发育过程中,外界损伤导致的肺发育受阻和异常修复。以往的研究多着重于对肺组织损伤机制的研究,已证实氧毒性和机械通气介导的损伤、炎症反应在BPD的发生过程中具有重要作用,但抗炎、抗氧化的治疗对BPD却没有取得确切的疗效。随着对BPD认识的不断深入,对于即参与正常肺发育又调控肺组织损伤修复机制的研究,成为研究BPD发病机制的新视野。已证实肺发育过程中,位于肺泡分隔顶端的弹性蛋白不断向前延伸发展,是肺泡逐渐形成的物质基础;而细胞外基质的异常分布、沉积则是纤维化发生的直接原因。与两者的发生均密切相关的肺成纤维细胞（lung fibroblast,LF）的作用日益受到人们的关注。LF的增殖活化是其执行生物学功能的基础,对调节其增殖活化的信号通路的认识将有助于我们进一步理解LF的功能及其在BPD发生中的意义。WNT信号通路是近年来才逐渐被人们认识到的一类控制细胞生长、增殖、传递细胞间相互调控信息的信号通路。其中WNT/β-catenin信号通路作为经典的WNT信号通路,已成为发育生物学及肿瘤学研究的热点。大量的研究证实,此信号通路活化的关键在于胞浆中是否存在结构稳定的β-catenin,以及其向胞核的转位。已有研究表明,早期肺发育（即支气管树形成）过程中WNT/β-catenin信号通路发挥了重要作用;且在对成人肺纤维化疾病的研究中发现WNT/β-catenin信号通路可能起着关键性的作用。但在肺泡化过程中WNT/β-catenin信号通路是否存在,其作用如何,在肺泡化障碍及肺纤维化的早产儿BPD中有何作用?到目前为止,鲜有报道。既然WNT/β-catenin信号通路参与调节肺发育及肺纤维化,且与细胞增殖分化有关,那么其在BPD中的作用是否通过促进LF增殖活化来实现?本研究拟从组织和细胞水平,观察WNT/β-catenin信号通路关键因子β-catenin及其下游基因TCF-1/LEF-1的活化情况,探讨WNT/β-catenin信号通路在BPD中的作用及其机制,完善BPD的发病机制,为BPD的预防和治疗提供一个新思路。实验材料与方法一、动物模型新生Wistar大鼠生后12h之内随机分为高氧组（A组）和空气组（B组）。A组置于玻璃氧箱中,持续输入氧气,FiO2=0.85±0.02（美国OM-25ME型测氧仪监测）。用钠石灰吸收CO2,使其浓度＜0.5%（Dapex气体分析仪）,温度22～25℃,湿度60%～70%。每天定时开箱15min,添水、饲料及更换垫料,并与空气组交换母鼠以免因氧中毒而致喂养能力下降。B组置于空气中（FiO2=0.21）,余控制因素同A组。二、标本的采集和处理每组分别于实验后3、7、14d随机选取8只称重,5%哥拉腹腔注射（0.6ml/100mg）麻醉后,分离气管,打开胸腔,暴露心肺,经气管缓慢注入4%多聚甲醛,然后置于4%多聚甲醛中,4℃过夜,石蜡包埋,制作4μm组织切片,用于肺形态学观察、免疫组织化学检测。或于打开胸腔后,剪开左心耳,经右心室插入套管至肺动脉,注入10ml生理盐水洗净肺内残血,收集肺组织,置于无RNase的Eppendorf管中,液氮速冻,—80℃冰箱保存,用于RT-PCR及Western-blot检测。三、细胞培养动物模型建立后,分别于实验第3、7、14天取每组2-3只动物进行肺组织LF原代培养,取传2-3代细胞进行检测。四、实验方法1、组织水平（1）动态观察各组新生大鼠的一般状态、监测体重。（2）肺形态学观察:①H&E染色;②弹性蛋白染色;③Masson染色。（3）免疫组织化学技术:α-平滑肌动蛋白（α-smooth muscle actin,α-SMA）、β-catenin蛋白检测。（4）Western-blot法:检测肺组织β-catenin蛋白表达。（5）RT-PCR法:检测肺组织α-表达。2、细胞水平（1）细胞培养及鉴定,MTT法检测细胞增殖情况。（2）免疫细胞化学技术:α-平滑肌动蛋白（α-smooth muscle actin,α-SMA）、β-catenin、波形蛋白检测。（3）免疫荧光:波形蛋白染色进行细胞鉴定。（4）Western-blot法:检测细胞β-catenin蛋白表达。（5）RT-PCR法:检测肺LF中β-catenin、TCF-1、LEF-1表达。五、统计学分析应用SPSS13.0统计软件进行统计学处理,数据以均值±标准差（（?）+s）表示,单因素多水平比较采用One Way ANOVA。两样本均数间比较采用Independent ftest。相关分析采用Spearman分析。结果以p＜0.05有意义。结果一、实验组和对照组新生大鼠一般状态比较A组新生鼠3d时肤色尚红润,脱离氧气后呼吸稍促,7d时出现少动、皮肤苍白以及离氧后呼吸频率稍快伴不同程度的发绀,随高氧暴露时间延长而逐渐加重,在14d时反应差,不活泼,体毛涩、无光泽,时有头颤;离氧后呼吸增快、出现呼吸困难、头颤明显,口周发绀。恢复氧供后可缓解。而B组始终反应较好,肤色红润,体重平稳增长,14天时睁眼。A组在高氧暴露7d开始,体重与B组相比下降（p＜0.05）,随着高氧暴露时间的延长,体重差异更加显著（p＜0.01）。二、肺形态学改变1、肺组织病理变化A组3d肺泡结构紊乱,间隔少量炎性细胞浸润;7d间隔有大量炎细胞浸润,肺泡腔有渗出,肺灶状出血;14d肺泡数量明显减少,形成肺大泡,间隔增厚,肺间质胶原沉积。B组14d肺泡大小均匀一致,肺泡间隔较薄。2、弹性蛋白染色结果显示B组7天、14天时弹性蛋白主要表达于次级隔顶端,呈“蘑菇”样改变。A组则主要表达于肺间质。3、Masson染色结果显示B组肺泡间隔较薄,少量蓝色胶原沉积,A组14d蓝色胶原呈条索状或呈束状沉积于增厚的肺间质内。三、细胞鉴定及细胞增殖测定按Kelleher等建立的方法分离、培养LF,并进行鉴定:1、形态学鉴定:倒置显微镜下LF呈梭形,有较长的突起,胞核呈卵圆形,位于细胞中央,呈放射状或栅栏状排列;2、免疫荧光:波形蛋白表达于胞浆,绿色荧光为波形蛋白阳性染色;3、免疫细胞化学染色:胞浆内棕黄色颗粒为阳性染色。MTT结果显示:A组LF生长较B组明显增加,实验各时间点均具有显著差异（p＜0.01）。四、α-SMA蛋白在肺组织及LF中表达的动态变化α-SMA主要表达于MF及血管平滑肌细胞。B组α-SMA 7天、14天时主要表达于次级隔顶端,与弹性蛋白表达部位基本一致,间质少有表达。A组7dα-SMA表达开始增加（p＜0.01）,表达部位主要在间质,14d在上述部位表达明显增强（p＜0.01）,与胶原蛋白表达一致性。在培养的LF中,胞浆中均存在α-SMA的阳性表达（＞95%）,表达强度随高氧暴露时间延长而增强,7d、14d与B组存在显著性差异（p＜0.01）。五、β-catenin在肺组织及LF中的表达1、β-catenin蛋白在肺组织中的动态表达免疫组化结果显示:B组3天肺组织支气管上皮细胞、部分肺泡上皮细胞、间质细胞胞核内均出现β-catenin表达,随着生后日龄的增加,在次级隔表达明显增多。A组自吸氧3d开始在上述细胞胞核中出现高表达,与B组具有显著性差异（p＜0.05）,7d、14d仍呈高表达（p＜0.01）,间质细胞核中表达明显增多。Western-blot结果与免疫组化结果基本一致,两组β-catenin表达随日龄增长均逐渐增加,A组增加更加显著。实验第3天始,两组β-catenin表达就出现显著性差异（p＜0.05）,7天及14天差异更为显著（p＜0.01）。2、β-catenin基因在肺组织中的动态表达RT-PCR结果显示:两组β-catenin基因表达随日龄增长逐渐增加,A组基因表达显著,其变化规律与蛋白表达趋势基本一致。两组内各时间点差异显著（p＜0.05）。3、β-catenin蛋白在LF中的动态表达免疫细胞化学结果显示:两组β-catenin均表达于细胞核内。Western-blot结果显示:两组细胞β-catenin表达随日龄增长逐渐增加,A组增加更加显著,其变化规律与组织水平表达趋势基本一致。4、β-catenin基因在LF中的动态表达RT-PCR结果显示:两组β-catenin基因表达随日龄增长逐渐增加,A组基因表达增长显著,其变化规律与蛋白表达趋势基本一致。两组内各时间点差异显著（p＜0.05）。六、TCF-1、LEF-1 mRNA表达的变化1、TCF-1/LEF-1 mRNA在肺组织中的表达变化RT-PCR结果显示:LEF-1 mRNA在A组自吸氧3d开始表达明显增强（p＜0.01）,7d、14d仍呈高表达,与B组有明显差异（p＜0.05）。两组TCF-1 mRNA表达无明显差异（p＞0.05）。2、TCF-1/LEF-1 mRNA在LF中的表达变化RT-PCR结果显示:两组细胞中TCF-1/LEF-1 mRNA表达与组织水平变化趋势一致。随日龄增长逐渐增加,LEF-1 mRNA在A组3d表达增强（p＜0.01）,7d、14d仍呈高表达,两组表达具有明显差异（p＜0.05）,而两组TCF-1 mRNA在实验各时点表达无明显差异（p＞0.05）。结论1、持续高浓度氧气暴露,可导致新生大鼠肺组织出现肺泡发育障碍和肺纤维组织增生等病理形态学改变,符合早产儿BPD的发生发展特点和病理学改变。2、肺肌成纤维细胞的异常分布（未到达肺泡分隔顶端而沉积于间质）可能是BPD肺泡发育障碍的机制之一。3、肺肌成纤维细胞沉积于间质并过度表达,与BPD肺泡损伤后修复障碍密切相关。肺肌成纤维细胞在BPD中的异常分布、表达可能是BPD的重要发病机制之一。4、以β-catenin为中心的WNT/β-catenin信号通路参与了BPD的发生。5、WNT/β-catenin信号通路参与BPD是通过激活其下游基因LEF-1实现的。6、MF可能是肺发育及BPD中LF的主要存在形式。7、WNT/β-catenin信号通路的活化可能与MF的增殖、活化有关。8、WNT/β-catenin信号通路促进MF过度增殖活化、抑制其向肺泡间隔迁徙可能是其在BPD中的作用机制。

论文目录

• 一、摘要
• 中文论著摘要
• 英文论著摘要
• 二、英文缩略语
• 三、论文
• 论文一 肌成纤维细胞在高氧致BPD新生鼠肺组织中的分布特点及表达规律
• 前言
• 实验材料与方法
• 实验结果（附论文图片）
• 讨论
• 结论
• 论文二 β-catenin在高氧致BPD新生鼠肺组织中的表达及其作用研究
• 前言
• 实验材料与方法
• 结果（附论文图片）
• 讨论
• 结论
• 论文三 β-catenin在原代培养肺成纤维细胞中的表达及其作用研究
• 前言
• 实验材料与方法
• 结果（附论文图片）
• 讨论
• 结论
• 四、本研究创新性的自我评价
• 五、参考文献
• 六、附录
• 综述
• 在学期间科研成绩
• 致谢
• 个人简介