静态注射化学发光法测定氧化酶活性的研究及应用

论文摘要

目的:氧化酶是一类催化底物氧化生成过氧化氢的酶,包括葡萄糖氧化酶和脂酰辅酶A氧化酶等,可通过检测其单位时间内H2O2的生成量测得其活性。因此,可利用分析速度快、仪器设备简单、灵敏度高、线性范围宽的化学发光法测定H2O2含量,反映氧化酶的活性。但目前,大多采用流动注射化学发光法,试剂消耗量较大,限制了此方法在小样品酶活性测定中的应用。因静态注射化学发光分析法,除了有前面提到的化学发光法的特点外,又有试剂用量小的优点,所以,本实验拟建立静态注射化学发光分析法,用于测定样品量较小、活性较低的氧化酶样本。水溶性好、光量子效率高的鲁米诺是常用的化学发光试剂。已有使用对碘苯酚增强的鲁米诺-过氧化氢-辣根过氧化物酶化学发光体系,测定痕量的辣根过氧化物酶的报道。基于以上原因,本文将对碘苯酚增强的鲁米诺-过氧化氢-辣根过氧化物酶化学发光体系与氧化酶反应偶联,用静态注射法测定酶促反应中H2O2的生成量,建立测定葡萄糖氧化酶活性和脂酰辅酶A氧化酶活性的新方法。并分别用于蜂蜜中葡萄糖氧化酶活性的测定,以及正常、2型糖尿病、单纯胰岛素抵抗的大鼠肝脏、心肌、脑组织的脂酰辅酶A氧化酶活性的测定。方法:采用两步法测定氧化酶的活性,即酶促反应和化学发光反应第一部分:葡萄糖氧化酶活性测定第一步:葡萄糖氧化酶催化葡萄糖氧化,产生向反应容器中加入20μl反应体系（含葡萄糖,0.1mol/L磷酸钾缓冲液）,加入10μl待测酶活性的样品溶液启动反应并计时。反应在35℃下进行。第二步:经鲁米诺化学发光反应,测定第一步中生成的H2O2量上述酶促反应一定时间后,立即将反应容器转移至IFFS-A型多功能化学发光检测器的闭光样品室内,用注射器取鲁米诺发光液400μl（含Luminol,HRP,PIP,磷酸钾缓冲液）从静态注射接口注入,终止葡萄糖氧化酶催化反应的同时启动发光反应（40℃下进行）,在光电倍增管负高压400V的条件下,记录化学发光响应信号,以其峰高为相对发光强度。根据H2O2标准曲线求出化学发光强度值对应的H2O2量,继而求出葡萄糖氧化酶的活性。葡萄糖氧化酶活性定义为35℃下,1分钟内催化葡萄糖氧化产生1μmole H2O2所需的酶量为1个单位（U）。第二部分:脂酰辅酶A氧化酶活性测定第一步:脂酰CoA氧化酶氧化软脂酰CoA,生成H2O2于反应容器中加入20μl反应体系（含软脂酰CoA,FAD,200μmol/L NAD,170μmol/L CoA,4mmol/LNaN3,5mmol/L EDTANa3,0.1mol/L磷酸钾缓冲液,pH8.5）,加入10μl待测酶活性的样品溶液启动反应并计时。反应在35℃下进行。第二步:经鲁米诺化学发光反应,测定第一步中生成的H2O2量上述酶促反应一定时间后,参照葡萄糖氧化酶活性测定中详述的方法,使用鲁米诺发光液测定H2O2并计算其浓度,继而可求出脂酰辅酶A氧化酶的活性。脂酰辅酶A氧化酶活性定义为,在本实验条件下,每分钟生成1μmol H2O2所需的酶蛋白量为1个活性单位（U）。结果:1葡萄糖氧化酶活性测定条件的优化1.1葡萄糖氧化酶反应:在0.1mol/L, pH 5.5磷酸钾缓冲液,0.2mol/L葡萄糖的反应体系中,35℃下,反应60min。1.2鲁米诺化学发光反应:在0.1mol/L,pH8.5磷酸钾缓冲液,40μmol/L鲁米诺,50μg/ml辣根过氧化物酶,20μmol/L对碘苯酚的体系中,40℃下反应。所建的葡萄糖氧化酶静态注射-化学发光法,其线性范围为1.67×10-4-3.0×10-3U/ml。所测样本的相对标准偏差为5.24%。2脂酰辅酶A氧化酶活性测定条件的优化2.1脂酰辅酶A氧化酶反应:在0.1mol/L pH8.5磷酸钾缓冲液30μmol/L,软脂酰辅酶A,10μmol/L FAD,200μmol/L NAD,170μmol/L辅酶A,4mmol/L NaN3,5mmol/L EDTANa3的反应体系中,40℃下,反应10min。2.2鲁米诺化学发光反应:条件同上所建的脂酰辅酶A氧化酶静态注射-化学发光法,所测样本的相对标准偏差为7.62%。3样本测定结果3.1蜂蜜葡萄糖氧化酶的测定结果:蜂蜜放置一年,其葡萄糖氧化酶的活性为5.379U/mg。3.2大鼠组织中脂酰辅酶A氧化酶的活性3.2.1肝组织脂酰辅酶A氧化酶活性测定结果:对照组为65.57±9.16 mU/mg,单纯胰岛素抵抗组为60.75±10.15 mU/mg,糖尿病组为78.33±12.18 mU/mg。糖尿病组与对照组相比,脂酰辅酶A氧化酶活性有所增加（P <0.05）,单纯胰岛素抵抗组与对照组相比,差异无统计学意义（P >0.05）。3.2.2心肌组织脂酰辅酶A氧化酶活性测定结果:对照组脂酰辅酶A氧化酶活性为31.81±5.54 mU/mg,单纯胰岛素抵抗组为30.69±3.74 mU/mg,糖尿病组为37.82±6.69 mU/mg。糖尿病组与对照组相比,脂酰辅酶A氧化酶活性有所增加（P <0.05）,单纯胰岛素抵抗组与对照组相比,差异无统计学意义（P >0.05）。3.2.3大鼠脑组织脂酰辅酶A氧化酶活性测定结果:对照组脂酰辅酶A氧化酶活性为19.86±4.40 mU/mg,单纯胰岛素抵抗组为15.74±2.90 mU/mg,糖尿病组为14.51±2.80 mU/mg。与对照组相比,单纯胰岛素抵抗组（P <0.05）和糖尿病组（P <0.01）的脂酰辅酶A氧化酶活性均有下降单纯胰岛素抵抗组。结论:1化学发光法测定葡萄糖氧化酶活性和脂酰辅酶A氧化酶活性,方法简便快捷、灵敏度高,可用于测定低酶活、小样品量的样品。该法应用于蜂蜜中葡萄糖氧化酶活性的测定及大鼠肝脏、心肌及脑组织中脂酰辅酶A氧化酶活性的测定中,结果满意。2 2型糖尿病病理条件下,大鼠肝脏及心肌组织脂酰辅酶A氧化酶活性增高,脑组织脂酰辅酶A氧化酶活性显著下降;单纯胰岛素抵抗病理条件下,肝脏及心肌组织脂酰辅酶A氧化酶活性正常,但脑组织脂酰辅酶A氧化酶活性已出现下降。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 引言
• 第一部分 静态注射化学发光法测定葡萄糖氧化酶活性的研究及应用
• 前言
• 材料与方法
• 结果与讨论
• 附图
• 结论
• 参考文献
• 第二部分 静态注射化学发光法测定脂酰辅酶A氧化酶活性的研究及应用
• 前言
• 材料与方法
• 结果与讨论
• 附图
• 附表
• 结论
• 参考文献
• 综述 过氧化物酶体的脂肪酸β-氧化活性缺陷的相关疾病及β-氧化活性的测定
• 参考文献
• 致谢
• 个人简历