IBDV VP2高变区基因片段的克隆、表达及其鉴定

论文摘要

传染性法氏囊病（IBD）是一种危害幼鸡的急性、高度接触性、病毒性传染病。传染性法氏囊病毒（IBDV）除引起3-6周龄易感鸡发生死亡外,可致雏鸡免疫抑制,导致鸡群对新城疫、马立克氏病及传染性支气管炎等多种主要疫病的免疫失败。为了建立一个准确快速的诊断方法,分析我国目前使用的疫苗株的抗原基因是否发生了变异以及进一步建立能够鉴别感染鸡体内是否是由疫苗免疫所产生抗体的方法,本研究初步建立了检测IBDV的RT-PCR方法、获得了VP2蛋白的抗原决定区域的基因,构建了该基因的重组质粒,并且成功表达了VP2基因的部分片段。首先,根据Genbank中已登录的传染性法氏囊病毒VP2基因序列和在前人研究成果的基础上,设计了含酶切位点和保护性碱基的一对引物,P1:5‘-CGGAATTCCCAAAAATGGTAGCCA-3‘P2:5‘-GCGTCGACTGCCACTCTTTCGTAGG-3‘,以弱毒疫苗灭菌生理盐水稀释液为毒种,SPF鸡胚接种法增殖IBDV病毒,以尿囊液离心后的沉淀物为材料,采用Trizol试剂法提取病毒的总RNA,进行RT-PCR,扩增出大小为504bp的基因片段(记为P12),与预期的结果一致。将其插入到质粒载体PGEX-4T-1上,转化大肠杆菌BL21,菌液PCR筛选阳性克隆和质粒PCR及双酶切鉴定后测序。序列分析表明,P12与登录号为DQ202329的国内毒株的同源性达99.8%以上,与国外毒株AY134874、AY598356、AF109154的同源性分别为93.5%、93.5%、94.8%,这表明本实验已成功地扩增了目的基因,为建立检测IBDV的RT-PCR快速诊断方法奠定了基础。其次,根据GenBank中登录的传染性法氏囊病毒基因序列及原核表达质粒pGEX-4T-1的多克隆位点,设计了另两条原核表达引物P3:5’-CGGAATTCATGCCATTCAATCTTGTG-3’;P4:5’-GCGTCGACTGCTAGTTCAGGAATTGG-3’。为了便于基因的克隆与表达,我们在引物的5’端添加了酶切位点及其保护碱基。以实验室保存的重组质粒为模板,扩增273bp的原核表达目的片段(记为P34),将其插入到表达载体PGEX-4T-1上,转入大肠杆菌BL21,经菌液PCR筛选阳性克隆、双酶切鉴定后,IPTG诱导表达,经SDS-PAGE电泳检测后,所表达的蛋白大小与预期结果一致。综上所述,本研究用SPF鸡胚尿囊液增殖法增殖了传染性法氏囊病毒,克隆了包括中和抗原表位在内的VP2基因高变区,并且成功表达了含有一个抗原位点的VP2基因片段,为RT-PCR方法的建立和基因工程疫苗的制备都打下了一定的实验基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 目录
• 插图和附表清单
• 常用中英文缩写
• 文献综述
• 引言
• 1.材料与方法
• 1.1 实验鸡胚
• 1.2 质粒和菌种
• 1.3 病毒和细胞
• 1.4 酶类及相关试剂
• 1.5 培养基
• 1.6 常用溶液配制
• 1.7 主要仪器
• 1.8 IBD病毒RT-PCR检测方法的建立及序列比较
• 1.8.1 引物设计
• 1.8.2 病毒的增值
• 1.8.3 病毒RNA的抽提
• 1.8.4 反转录合成第一链cDNA
• 1.8.5 cDNA的PCR扩增
• 1.8.6 RT-PCR产物的回收与纯化
• 12重组质粒的构建与鉴定'>1.8.7 PGEX-4T-1-P₁2重组质粒的构建与鉴定
• 1.8.8 RT-PCR产物的序列测定与序列分析
• 1.9 IBDV部分VP2基因的原核表达
• 1.9.1 引物设计
• 1.9.2 表达片段的PCR扩增
• 1.9.3 PCR产物的回收与纯化
• 34的构建与鉴定'>1.9.4 原核表达重组质粒pGEX-4T-1-P₃₄的构建与鉴定
• 1.10 GST-VP2融合蛋白的大量提取与纯化
• 1.11 GST-VP2融合蛋白的定量
• 1.12 鼠抗IBDV VP2多克隆多抗的制备与鉴定
• 2.结果与分析
• 2.1 IBDV部分VP2基因的克隆及序列比较
• 2.1.1 病毒的增殖
• 2.1.2 病毒总RNA的提取
• 12'>2.1.3 RT-PCR扩增目的基因P₁₂
• 2.1.4 菌液PCR鉴定阳性克隆
• 2.1.5 重组质粒PCR鉴定及双酶切鉴定
• 12基因的序列测定结果'>2.1.6 P₁₂基因的序列测定结果
• 12基因核苷酸序列的同源性比较'>2.1.7 P₁₂基因核苷酸序列的同源性比较
• 2.2 IBDV部分VP2基因的原核表达
• 34的扩增'>2.2.1 原核表达片段P₃₄的扩增
• 34的双酶切鉴定'>2.2.2 重组质粒PGEX-4T-1-P₃₄的双酶切鉴定
• 34的原核表达'>2.3 重组质粒pGEX-4T-1-P₃₄的原核表达
• 2.3.1 pGEX-4T-1-P34原核表达蛋白的鉴定
• 2.3.2 原核表达重组质粒pGEX-4T-1-P34最佳诱导时间的确定
• 2.3.3 原核表达重组质粒pGEX-4T-1-P34最佳诱导浓度的确定
• 2.3.4 GST-VP2融合蛋白的大量提取结果
• 2.3.5 GST-VP2融合蛋白的浓度测定
• 2.4 鼠抗鸡GST-VP2多克隆抗体效价测定及鉴定
• 2.4.1 琼脂免疫双向扩散测定多抗结果
• 2.4.2 ELISA测定多抗效价结果
• 3.讨论
• 3.1 IBDV的增殖及其RNA的提取
• 12片段的扩增'>3.2 传染性法氏囊病毒P₁₂片段的扩增
• 3.3 表达系统的选择
• 3.4 包涵体的形成
• 3.5 GST-VP2融合蛋白的可溶性表达
• 3.6 GST-VP2融合蛋白浓度的测定
• 4.结论
• 参考文献
• 致谢
• 附录
• 作者简介