卤虫胚胎发育相关基因p26的克隆和表达分析

论文摘要

卤虫是一种生活在世界各地的小型甲壳动物,它们能够抵抗长期缺氧、干燥、极端的温度、高盐、高剂量的紫外辐射等恶劣环境。p26对卤虫抵抗恶劣环境可能起到重要作用。p26是一种小热激蛋白,作为分子伴侣,在防止蛋白变性和聚合,帮助蛋白折叠以及抑制凋亡起重要的作用。p26的表达具有胚胎特异性,只在包囊和进入休眠状态的胚胎中表达。本研究根据GenBank上中国卤虫p26基因的mRNA序列设计引物,以中国卤虫总RNA为模板,经RT-PCR,得到了长542 bp的基因片段,该片段的A+T的含量高于G+C的含量,该序列片段经Blastn比对,确认其是中国卤虫p26基因的部分序列。通过对该序列进行ORF分析得出其假定表达的蛋白包含174个氨基酸,而且该蛋白包含α-crystallin结构域。用ClustalW 1.83和MEGA 3.0软件对该假定蛋白的氨基酸序列和相近蛋白的氨基酸序列进行分子进化分析,构建的进化树分为两支,中国卤虫和其他昆虫的sHSP聚为一支,另外一支是由脊椎动物的sHSP组成。同时本研究对8个地区的两性生殖卤虫p26基因进行了克隆测序,用ClustalW软件比对并用MEGA3.0软件分析其碱基组成即变异情况,并构建分子系统进化树,构建的两支进化树均显示两性卤虫可分为四个类群:第一类群:东亚两性类群;第二类群:中亚两性类群;第三种群:北美类群和第四类群:南美类群。为了分析胚胎发育相关基因p26的表达和胚胎发育的关系,本研究首次用实时定量PCR分析中国山西运城两性卤虫和山东无棣县孤雌卤虫不同胚胎发育时期p26基因的相对表达量,实验结果表明利用实时定量PCR获得了理想的标准曲线,可以在宽广的范围内对目的基因进行检测,对各个样品进行实时定量PCR时,均获得了良好的扩增曲和融解曲线,表明实时定量PCR方法简便、快速、高效、可行。在胚胎发育的各个时期,中国两性卤虫和孤雌卤虫均表达p26,而且除了0 h外,在其他的几个发育时期,两性卤虫p26基因的表达量均高于孤雌卤虫;在胚胎发育0 h时,中国两性卤虫和孤雌卤虫均表达最大量的p26;随着胚胎发育的进行,p26基因的表达量逐渐减少,在胚胎发育16 h和24 h,p26基因的表达量很低。我们推断p26在胚胎发育过程中保护胚胎抵抗恶劣环境起到重要作用。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 前言
• 1.1 卤虫的生物学特征
• 1.2 卤虫相关基因的研究
• 1.3 卤虫的分子生物学和分子群体遗传学研究
• 1.3.1 卤虫的同工酶的研究
• 1.3.2 卤虫的mtDNA 的研究
• 1.3.3 卤虫的群体遗传学的研究
• 1.4 热激蛋白结构及功能的研究进展
• 1.4.1 HSP 的发现及分类
• 1.4.2 sHSP 基因的结构特征
• 1.4.3 sHSP 蛋白结构及作用机理
• 1.4.4 sHSP 的生物学功能
• 1.4.5 海洋生物中热激蛋白的研究现状
• 1.5 p26 基因概述
• 1.6 实时定量 PCR
• 1.6.1 实时定量 PCR 的原理
• 1.6.2 实时定量 PCR 的检测方法
• 1.6.3 实时定量 PCR 的优点
• 1.6.4 实时定量 PCR 存在的问题
• 1.6.5 实时定量 PCR 的应用
• 1.6.6 实时定量 PCR 的应用前景
• 1.7 本研究的目的和意义
• 2 材料与方法
• 2.1 研究材料
• 2.2 主要药品与仪器
• 2.2.1 药品与试剂
• 2.2.2 仪器与设备
• 2.3 方法
• 2.3.1 卤虫孵化及培养条件
• 2.3.2 总 RNA 的提取
• 2.3.3 总 RNA 模板的纯化
• 2.3.4 RNA 的检测和浓度的测定
• 2.3.5 普通 PCR
• 2.3.6 实时定量 PCR
• 3 结果
• 3.1 总 RNA 的提取结果
• 3.2 p26 基因 PCR 扩增结果及序列分析
• 3.2.1 p26 基因 PCR 扩增结果
• 3.2.2 p26 基因序列生物信息学分析
• 3.2.3 p26 基因进化
• 3.2.4 根据p26基因序列分析两性卤虫进化
• 3.3 实时荧光定量PCR的优化条件
• 3.4 标准曲线和线性关系
• 3.5 扩增曲线和融解曲线分析
• 3.6 p26 基因的的表达量
• 3.7 p26 基因的的表达量和胚胎发育之间的关系
• 4 讨论
• 4.1 p26 基因的克隆和表达分析
• 4.1.1 p26基因序列分析
• 4.1.2 p26基因的表达分析
• 4.1.3 p26 基因的表达调控
• 4.2 分子进化
• 4.2.1 p26基因的分子进化
• 4.2.2 根据p26 基因序列分析两性卤虫进化
• 4.3 实验方法的优化
• 4.3.1 卤虫 RNA 的提取
• 4.3.2 引物设计原则
• 4.3.3 关于 PCR 体系优化
• 5 结论
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 论文发表情况