芽孢杆菌褐藻胶裂解酶的实验室制备及其基因克隆与表达的研究

论文摘要

随着对褐藻胶寡糖的生理活性和功能性质不断研究,发现褐藻胶寡糖除具有溶解性强、稳定性高及安全无毒等理化特性,还具有抗病毒和抑菌活性等生理活性,因此广泛的应用于医药和特定保健品等领域,并且大量的褐藻胶寡糖还是制备生物乙醇的良好来源。褐藻胶的酶解法制备褐藻胶寡糖,因具有反应条件易控制、底物特异性高等特点而成为主要研究方向。国内外已筛选出多种褐藻胶裂解酶生产菌,并将其分离提纯。大部分产酶的微生物生长条件特殊,产酶量低,分离困难限制了这一产业的发展。随着基因工程的发展,将褐藻胶裂解酶的基因克隆到适于工业化生产的宿主细胞,获得高产量的褐藻胶裂解酶已经迫在眉睫。目前为止大约有20个来源于细菌的褐藻胶裂解酶基因成功克隆并测序,这些重组酶大都只能作用于古罗糖醛酸和甘露糖醛酸其中的一种。有研究报道发现来源于芽孢杆菌的褐藻胶裂解酶对这两种多糖都能降解,而这可能成为褐藻胶寡糖工业用酶生产的重要有利条件。目前尚未见来源于芽孢杆菌的褐藻胶裂解酶基因克隆表达的研究报道。本文对芽孢杆菌产褐藻胶裂解酶进行研究。本文对影响菌株产酶能力的8个因素:碳源浓度、氮源浓度、温度、pH、转速、接种量、装液量和时间进行了单因素、Plackett-Burman及响应面实验,确定了菌株产酶最适培养条件:以0.7%海带粉为碳源,以0.44%蛋白胨为氮源,起始pH值为7.35,装液量为65mL、接种量为5%、37°C、180r/min的条件下在摇床中培养42h,酶活值为6.4U/mL。根据Genebank中褐藻胶裂解酶的同源序列（CM000725.1）设计引物,克隆了该褐藻胶裂解酶的编码基因algl,全长DNA为1035bp,包含一个由334个氨基酸组成的开放阅读框。该基因已在GenBank中注册,登录号为GU585575。ALGL氨基酸序列显示了同其他微生物来源的褐藻胶裂解酶低同源性。在来源于不同物种的分子量大小为40 kD的褐藻胶裂解酶中,发现大都存在保守序列“NNHSYW”,并认为此保守序列对酶的活性至关重要。本研究中,重组酶ALGL中并无此保守序列,该酶活性中心有待进一步研究,以作为深入研究芽孢杆菌ALGL最小活性单位的重要基础。将经BamHⅠ和HindⅢ双酶切的algl基因和原核表达载体pET-30a（+）进行连接,构建成原核表达载体pET30a-algl,并转化大肠杆菌E. coli BL21（DE3）。经IPTG诱导培养4-5 h,目的蛋白得到大量表达,SDS-PAGE电泳检测,在约45 kDa处有一条明显的蛋白带,蛋白大小要大于从该几褐藻胶裂解酶氨基酸序列估计的蛋白分子量;而空质粒pET-30a（+）转化BL21经诱导培养后无相应蛋白产生。可溶性分析结果显示,表达的蛋白以部分可溶形式存在,存在包涵体可能由于外源蛋白在宿主细胞中的过量表达造成的。分别对褐藻胶裂解酶基因的诱导表达条件进行优化,确定了产重组蛋白最佳条件为:IPTG的终浓度为0.4 mmol/L,培养温度为32°C,添加IPTG后培养4 h。在此条件下重组蛋白的表达量最高,约占菌体总蛋白的36%。在酶学性质方面,纯化后的ALGL属于中性酶且只能在较窄pH范围内保持较高的酶活力,在pH 6.6时酶活力达到最大值。酶的最适反应温度35°C,在酶的热稳定性实验中发现褐藻胶裂解酶的热稳定性比较差。ALGL受金属离子影响较大,Ca2+、Mg2+对酶活有激活作用,金属离子是褐藻胶裂解酶获得最大活性所必须的,但是由于酶的性质的差异,不同来源的褐藻胶裂解酶,其受金属离子的影响是不同的。ALGL催化褐藻胶的Km值为1.89 mg/mL,Vmax为15.01 U/mL。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 引言
• 1.1 褐藻胶
• 1.1.1 褐藻胶的组成结构
• 1.1.2 褐藻胶的来源
• 1.1.3 褐藻胶及褐藻寡糖的应用
• 1.2 褐藻胶降解方法
• 1.3 褐藻胶裂解酶
• 1.3.1 褐藻胶裂解酶的来源
• 1.3.2 褐藻胶裂解酶的作用机理
• 1.3.3 褐藻胶裂解酶的分类
• 1.3.4 褐藻胶裂解酶活性检测方法
• 1.3.5 褐藻胶裂解酶的理化性质
• 1.3.6 褐藻胶裂解酶的结构特征
• 1.3.8 褐藻胶裂解酶的基因工程研究
• 1.3.9 藻胶裂解酶的应用
• 1.4 本研究的内容及预期目标
• 1.4.1 本研究的内容
• 1.4.2 预期目标
• 第二章 产褐藻胶裂解酶的发酵条件优化
• 2.1 引言
• 2.2 材料与设备
• 2.2.1 培养基
• 2.2.2 菌种
• 2.2.5 实验仪器及设备
• 2.3 实验方法
• 2.3.1 酶活力的测定
• 2.3.2 种子液的制备
• 2.3.3 单因素实验
• 2.3.3.1 海带粉碳源浓度对产酶能力的影响
• 2.3.3.2 氮源（蛋白胨）添加量对产酶能力的影响
• 2.3.3.3 初始pH 对产酶能力的影响
• 2.3.3.4 温度对产酶能力的影响
• 2.3.3.5 转速对产酶能力的影响
• 2.3.3.6 接种量对产酶能力的影响
• 2.3.3.7 摇瓶培养基装液量对产酶能力的影响
• 2.3.3.8 培养时间对产酶能力的影响
• 2.3.4 Plackett-Burman 法筛选影响产酶的重要因素
• 2.3.5 响应面实验
• 2.4 结果与讨论
• 2.4.3 单因素实验结果
• 2.4.3.1 碳源（海带粉）添加量对产酶能力的影响
• 2.4.3.2 氮源（蛋白胨）添加量对产酶能力的影响
• 2.4.3.3 初始pH 对产酶能力的影响
• 2.4.3.4 温度对产酶能力的影响
• 2.4.3.5 转速对产酶能力的影响
• 2.3.3.6 接种量对产酶能力的影响
• 2.3.3.7 摇瓶培养基装液量对产酶能力的影响
• 2.3.3.8 培养时间对产酶能力的影响
• 2.4.4 影响褐藻胶裂解酶产生的关键因素确定
• 2.4.5 关键因素对酶活的影响
• 2.4.5.1 酶活多元二次模型方程的建立
• 2.4.5.2 酶活响应面分析与优化
• 2.4.5.3 寻求最优值
• 2.5 小结
• 第三章 褐藻胶裂解酶基因的克隆
• 3.1 引言
• 3.2 材料与设备
• 3.2.1 菌种
• 3.2.2 主要试剂和试剂盒
• 3.2.3 实验仪器及设备
• 3.2.4 培养基
• 3.2.4.1 LB 培养基
• 3.2.4.2 含Amp 的LB 平板的制备
• 3.2.4.3 LB 抗性平板的制备
• 3.3 实验方法
• 3.3.1 微生物基因组DNA 提取
• 3.3.2 引物设计与PCR 反应条件
• 3.3.2.1 algL 基因的克隆
• 3.3.2.2 algL 基因PCR 反应条件
• 3.2.3 琼脂糖凝胶电泳
• 3.2.4 PCR 产物或酶切产物条带的回收
• 3.2.5 PCR 产物与克隆载体的连接
• 3.2.6 连接液转化大肠杆菌并进行蓝白斑筛选
• 3.2.7 阳性克隆的PCR 验证
• 3.2.8 基因的序列测定
• 3.2.9 ALGL 的蛋白序列分析
• 3.4 实验结果
• 3.4.1 algL 基因扩增
• 3.4.2 algL 基因序列分析
• 3.4.3 不同微生物来源褐藻胶裂解酶氨基酸序列比对分析
• 3.5 小结
• 第四章 褐藻胶裂解酶基因的原核表达
• 4.1 引言
• 4.2 材料与设备
• 4.2.1 菌种
• 4.2.2 主要试剂和试剂盒
• 4.2.3 实验仪器及设备
• 4.2.4 主要试剂的配置
• 4.2.4.1 磷酸缓冲盐溶液（PBS）
• 4.2.4.2 10×SDS-PAGE 电泳缓冲液
• 4.2.4.3 2×SDS-PAGE 上样缓冲液
• 4.2.4.4 30%丙烯酰胺溶液（凝胶储备液）
• 4.2.4.5 1.5mol/L Tris-Hcl （pH 8.8）
• 4.2.4.6 1.0mol/L Tris-Hcl （pH 6.8）
• 4.2.4.7 10%SDS
• 4.2.4.8 10%过硫酸铵（AP）
• 4.2.4.9 四甲基乙二胺（TEMED）
• 4.2.4.10 脱色液
• 4.2.4.11 考马斯亮兰染色液
• 4.3 方法
• 4.3.1 algL 基因的获得
• 4.3.2 algL 基因双酶切
• 4.3.3 质粒的提取
• 4.3.4 质粒的双酶切
• 4.3.5 重组质粒的构建
• 4.3.6 基因工程菌的构建
• 4.3.6 基因工程菌的双酶切鉴定
• 4.3.7 工程菌的诱导表达及重组蛋白表达形式鉴定
• 4.3.8 SDS-PAGE 检测蛋白方法
• 4.3.9 褐藻胶裂解酶基因的诱导表达条件优化
• 4.4 结果
• 4.4.1 pET30a-algl 重组表达载体的构建及鉴定
• 4.4.2 重组质粒在大肠杆菌中的诱导表达
• 4.4.3 重组质粒在大肠杆菌中的表达条件优化
• 4.4.3.1 IPTG 浓度
• 4.4.3.2 培养时间
• 4.4.3.3 培养温度
• 4.5 小结
• 第五章 褐藻胶裂解酶重组蛋白的纯化及性质研究
• 5.1 引言
• 5.2 材料与设备
• 5.2.1 试剂
• 5.2.1.1 1×Ni-NAT 结合缓冲液
• 5.2.1.2 1×Ni-NAT 漂洗缓冲液
• 5.2.1.3 1×Ni-NAT 洗脱缓冲液
• 5.2.2 实验仪器及设备
• 5.3 实验方法
• 5.3.1 重组酶粗酶液的制备
• 5.3.2 重组酶的纯化
• 5.3.3 Bradford 定量测定蛋白浓度
• 5.3.4 ALGL 酶学性质研究
• 5.3.4.1 ALGL 最适催化pH 和pH 稳定性测定
• 5.3.4.2 ALGL 最适催化反应温度和温度稳定性测定
• 5.3.4.3 ALGL 金属离子、抑制剂等物质对ALGL 酶活力影响的测定
• 5.3.5 ALGL 酶催化反应动力学研究
• 5.4 实验结果
• 5.4.1 ALGL 的纯化及酶活测定结果
• 5.4.2 ALGL 的酶学性质研究
• 5.4.2.1 pH 对ALGL 酶活力和稳定性的影响
• 5.4.2.2 温度对ALGL 酶活力和稳定性的影响
• 5.4.2.3 金属离子、EDTA 对ALGL 酶活力的影响
• 5.4.3 ALGL 酶催化反应动力学研究
• 5.5 小结
• 全文总结
• 参考文献
• 目录
• 致谢