论文摘要
研究背景胆囊癌是胆道系统最常见的恶性肿瘤,预后差。大多数胆囊癌患者确诊时已晚期,其预后与肿瘤侵犯转移密切相关。因此研究胆囊癌转移的相关机制,对胆囊癌转移的预防和治疗具有重要意义。近来研究发现多肿瘤细胞高表达趋化因子受体CXCR4,高表达CXCR4的肿瘤细胞,可能在其特异性配体SDF-1的趋化作用下,转移至SDF-1产生源的某些器官,从而形成器官特异性的转移。目前为止,CXCR4在胆囊癌转移过程中所起的作用机制尚未见报道。本课题研究探讨CXCR4在胆囊癌组织中的表达及其与胆囊癌临床预后的关系;研究SDF-1/CXCR4信号通路在胆囊癌增殖侵袭和转移过程中的作用,利用shRNA干扰技术沉默CXCR4基因,研究CXCR4对胆囊癌细胞增殖侵袭和转移的影响,以寻求胆囊癌治疗的新途径。第一部分:CXCR4在胆囊癌组织中的表达及其临床意义目的:本部分研究检测CXCR4在胆囊癌组织中的表达,研究其与临床病理因素间的关系及其对胆囊癌预后的影响。方法:应用免疫组织化学法检测72例胆囊癌组织标本及20例慢性胆囊炎胆囊粘膜组织标本中CXCR4表达情况,结合临床资料进行分析,CXCR4表达阳性组与阴性组生存分析用Kaplan-Meier法,组间分析用log-rank检验,多因素分析采用Cox回归多因素模型,CXCR4在胆囊癌组织中的表达与临床病理因素的相关性采用χ2检验。结果:CXCR4在胆囊癌组织中高表达,胞浆及胞核染色,阳性率为69.4% ,CXCR4在慢性胆囊炎胆囊粘膜上皮弱表达,胞浆染色,胞核未见染色,阳性率为10%。胆囊癌临床病理因素的关系分析显示,CXCR4的表达在不同的胆囊癌TNM分期患者中,Ⅲ期和Ⅳ期者CXCR4表达明显高于Ⅰ期和Ⅱ期者,差异具有统计学意义（P<0.05）;CXCR4表达在胆囊癌淋巴结转移组中明显高于无淋巴结转移组,差异具有统计学意义（P<0.05）。生存分析表明CXCR4阳性患者术后生存期明显短于CXCR4阴性患者,差异具有统计学意义（P<0.001）,多因素分析表明CXCR4表达水平是影响胆囊癌患者手术后生存的独立因素。第二部分:siRNA干扰沉默CXCR4基因对人胆囊癌细胞株CXCR4表达的影响目的:探讨siRNA-CXCR4对人胆囊癌细胞株CXCR4基因转录及蛋白表达的影响。方法:通过慢病毒感染胆囊癌细胞GBC-SD,siRNA-CXCR4沉默CXCR4基因后,应用RT-PCR,Western-blot检测人胆囊癌细胞GBC-SD的CXCR4mRNA及其蛋白的表达。结果:siRNA-CXCR4作用于人胆囊癌细胞株GBC-SD后,CXCR4mRNA表达显著下调,明显抑制CXCR4蛋白表达。第三部分:siRNA干扰沉默CXCR4基因对人胆囊癌细胞增殖、粘附、侵袭及转移能力的影响目的:研究siRNA干扰沉默CXCR4基因对人胆囊癌细胞增殖、粘附、侵袭、及转移能力的影响。方法:胆囊癌细胞GBC-SD分为三组:GBC-SD、阴性对照组GBC-SD（siRNA- NC）及干扰组GBC-SD（siRNA-CXCR4）。应用CXCR4的配体SDF-1α（趋化因子）作用于这三组细胞,CCK-8法检测三组细胞增殖能力; Transwell小室运动侵袭试验检测细胞迁移和侵袭能力;CCK-8法检测细胞的黏附能力;荧光显微镜观察细胞骨架变化;明胶酶谱法检测细胞上清MMPs变化;Elisa法检测细胞上清VEGF-C及VEGF-D变化。结果:不同浓度SDF-1α对胆囊癌细胞GBC-SD的增殖均无影响,对MMP2及VEGF-D分泌无影响,SDF-1α浓度为200ng/ml时,GBC-SD细胞迁移、侵袭及粘附能力最强,分泌MMP9及VEGF-C最多,SDF-1α作用下GBC-SD细胞骨架改变,细胞伪足形成。应用浓度为200ng/ml的SDF-1α作用于GBC-SD（siRNA-CXCR4）、GBC-SD（siRNA- NC）和GBC-SD三组细胞, GBC-SD（siRNA-CXCR4）较GBC-SD增殖能力无明显变化（P=0.706）、而细胞迁移能力下降（P<0.01）、细胞侵袭能力下降（P<0.01）、粘附能力下降（P<0.01）;细胞伪足形成受到抑制、细胞分泌MMP9及VEGF-C减少（P<0.01）,对MMP2及VEGF-D分泌无影响。第四部分:胆囊癌细胞GBC-SD CXCR4活化后细胞信号通路的激活及其对GBC-SD迁移侵袭能力的影响目的:研究胆囊癌细胞GBC-SD在CXCR4活化后细胞信号通路的激活,及其对GBC-SD迁移侵袭能力的影响。方法:SDF-1作用于胆囊癌细胞株GBC-SD、GBC-SD（siRNA-CXCR4）及GBC-SD（siRNA-NC）后,提取细胞蛋白,Western-Blot法检测比较细胞中Akt及ERK1/ERK 2的信号通路的激活情况;Transwell小室迁移侵袭试验中加入PI/3K- Akt抑制剂LY294002及MEK-ERK抑制剂U0126,检测Akt及ERK1/ERK 2的信号通路在GBCSD细胞侵袭试验过程中的作用。结果: SDF-1α作用下GBC-SD、GBC-SD（siRNA-NC）及GBC-SD（siRNA-CXCR4）细胞Akt及ERK1/ERK2磷酸化激活, GBC-SD与GBC-SD（ siRNA-NC ）之间磷酸化Akt含量无明显差别（ P=0.072）, GBC-SD（siRNA-CXCR4）Akt活化明显减少（P<0.01）;GBC-SD与GBC-SD（siRNA-NC）之间磷酸化ERK1/ERK2无明显差别（P=0.055）,GBC-SD（siRNA-CXCR4）ERK1/ERK2活化明显减少（P<0.01）;迁移侵袭试验中加入LY294002后下室的GBC-SD细胞数量减少,各组间迁移侵袭细胞数差别有统计学意义（P<0.01）;加入U0126后下室的GBC-SD细胞数量减少,各组间迁移侵袭细胞数差别有统计学意义（P<0.01）。结论:1、胆囊癌组织中异常高表达趋化因子受体CXCR4,CXCR4的表达水平与胆囊癌分期及淋巴结转移密切相关,提示胆囊癌原发灶浸润侵犯情况及淋巴结转移情况与胆囊癌CXCR4表达有关。2、CXCR4在胆囊癌组织的表达是影响胆囊癌术后患者生存的独立因素,CXCR4阳性患者较CXCR4阴性患者预后差。3、SDF-1/CXCR4轴对胆囊癌细胞GBC-SD增殖能力无影响,SDF-1/CXCR4轴可促使胆囊癌细胞GBC-SD骨架改变、促进细胞伪足形成、增强细胞粘附能力和迁移侵袭能力、促进细胞分泌VEGF-C和MMP-9。siRNA干扰沉默CXCR4基因后可明显抑制SDF-1/CXCR4轴所致的这些促进作用。4、SDF-1/CXCR4生物轴可通过激活胆囊癌细胞内Akt及ERK1/ERK 2信号通路,来增强胆囊癌细胞GBC-SD的迁移侵袭能力。
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