盐芥激活标签突变体库的建立及过量表达YAP1对拟南芥耐盐性的影响

论文摘要

土壤盐渍化是目前影响农作物产量和质量的最主要原因之一。植物对盐胁迫的适应非常复杂,提高作物的耐盐性仍然面临着极大的挑战。因此,分析植物对于盐胁迫的反应,寻找耐盐相关基因,研究其反应机制,不仅对于揭示植物耐逆的机理具有重要的理论意义,而且对于耐盐作物的培育具有重要的实践意义。到目前为止,拟南芥一直是研究植物分子生物学途径的最好模式材料,但拟南芥是真正的甜土植物,因此,使用拟南芥将只能揭示关于植物耐盐性较少的信息。作为拟南芥近缘的盐芥,是很有前景的植物耐盐模式系统。盐芥具有拟南芥很多同样的优点以作为模式系统:如类似的形态、小的基因组、短的生活史、丰富的种子和易于被转化等。而且,盐芥是真盐生植物,短时间内能耐受高达500mMNaCl的冲击,在盐适应前后既不产生盐腺也没有复杂的形态上的变化,表明其耐盐性很大程度上源于基本的生理和生化机制。此外,盐芥和拟南芥在cDNA和氨基酸水平上分别有90%和95%的同源性,可以方便的将拟南芥的很多信息（基因、蛋白质数据库以及突变体系等）移至盐芥耐盐性的分子生物学研究。目前,对盐芥生理生化的研究、基因表达的研究,以及各种cDNA文库、突变体库的建立,已经使盐芥成为一种非常有价值的耐盐研究模式系统。随着盐芥基因组测序的即将完成,盐芥功能基因组学研究将会成为研究工作的重点,而功能基因组学的研究是建立在获得大量突变体的基础上的,饱和诱变和饱和插入是植物基因组学研究中的两种策略,而通过基因标签法建立大规模的突变体库是目前植物功能基因组学研究的最直接有效的方法。其中,激活标记法不仅能产生一般意义的功能丧失突变体,更重要的是能得到功能获得突变体,对于功能冗余基因以及生命周期多阶段必需基因的研究具有独特的优势。酿酒酵母转录因子yap1（Saccharomy cescerevisiae）在酵母中调节多达70个与氧化胁迫相关的基因的表达,在抗氧化胁迫反应中起着重要的作用。但是YAP1基因在高等植物中异源表达及对其影响还未见报道,因此YAP1基因在拟南芥中过量表达,对研究细胞抗氧化胁迫能力及运用基因工程手段有效地提高植物的抗逆性具有重要意义。本论文的主要目的是建立耐盐模式植物盐芥的激活标签突变体库,为发掘利用盐芥的耐盐基因,揭示盐芥耐盐的分子机理奠定基础,同时研究了酵母转录因子YAP1基因在拟南芥中过量表达的功能。主要结果如下:1.盐芥激活标记突变体库的建立以耐盐模式植物盐芥为实验材料,通过农杆菌介导的花浸染法将激活标记载体pSKI015导入盐芥基因组,试图建立一定规模的盐芥激活标记突变体库。主要结果如下:（1）通过农杆菌介导的花侵染法,利用激活标记载体pSKI015对盐芥进行了遗传转化,共获得转化T0代种子1000g左右,通过除草剂筛选,共获得抗性苗约2000株。（2）通过对所获得的盐芥除草剂抗性苗随机取约800株进行bar基因的PCR检测,阳性率在85%以上,证明采用除草剂对转化突变体进行筛选是可行的。（3）通过对获得的2000株激活标记抗性苗,采用TAIL-PCR的方法进行农杆菌T-DNA插入盐芥基因组侧翼序列的扩增,并进行测序,得到侧翼序列150余条,并进行了相关的序列分析。本实验的目的是建立饱和的盐芥激活标记突变体库,但由于各种因素的限制,所获得的体变体的数量还远远不够,大规模的突变体库还在构建之中。利用TAIL-PCR进行侧翼序列的扩增已获得初步成功,只是对于PCR产物的测序方法还有待于进一步完善。2、YAP1基因在拟南芥中的过量表达通过RT-PCR的方法克隆到YAP1基因,并将其构建到植物表达载体pROKII中,导入农杆菌后,进行植物遗传转化,实现其在拟南芥中过量表达,在含30mg/L的卡那霉素的培养基上筛选获得纯合转基因株系,自交一代获得足够的纯合转基因种子后,对其进行了分子生物学的验证及生理指标的检验,结果如下:（1）通过对转基因植株进行PCR扩增,得到了1.95Kb的特异条带,表明YAP1已整合至拟南芥基因组中;（2）Northern杂交分析表明转基因植株均有杂交信号,野生型植株无明显信号,进一步说明YAP1基因整合到拟南芥的基因组后已正常转录表达。（3）在含不同浓度的NaCl（0-150mmol/L）MS培养基上,YAP1基因的过量表达提高了转基因拟南芥的种子萌发率及幼苗的耐盐性。（4）在盐胁迫条件下,转YAP1基因拟南芥表现出比野生型更高的耐盐性,主要表现在:在盐胁迫下,转基因植株保持了更高的光反应效率, MDA、H2O2含量及细胞膜透性明显低于对照,表明YAP1基因减轻了植株的氧化损伤。（5）在盐胁迫条件下,转YAP1基因植株抗氧化保护酶SOD、CAT、POD、APX、GST及GR的酶活性都显著高于对照,表明酵母YAP1基因在高等植物异源表达能够起到类似转录因子的作用,在胁迫条件下,调控了一系列抗氧化保护酶的表达,增强了拟南芥的抗盐性。本论文的主要创新点:1.以耐盐研究模式植物盐芥为材料,通过农杆菌介导的花侵染法将激活标记载体pSKI015大规模的对盐芥进行转化,建立盐芥激活标签突变体库。目前已获得激活标记突变体2000株,并对所获得的突变体T-DNA插入盐芥基因组侧翼序列进行了扩增,Blast序列比对分析。在本实验室首次较系统的对盐芥激活标记突变体库的建立中的各个环节进行详细研究,为后续研究盐芥的抗盐机理,耐盐基因的发掘利用奠定了基础。2.从酿酒酵母克隆得到了转录因子YAP1基因,并首次在高等植物拟南芥中进行异源表达,对转化植株进行了相关的分子检测,并对转基因植株的耐盐水平进行了较全面的分析,为进一步培育耐盐作物奠定了基础。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 第一部分 文献综述
• 1 高盐对植物的影响
• 1.1 渗透胁迫
• 1.2 离子毒害
• 2 植物耐盐机理
• 2.1 渗透调节
• 2.1.1 调节矿质元素的吸收和分布
• 2.1.2 合成积累有机溶质
• 2.1.3 LEA 蛋白的调节作用
• 2.2 活性氧清除
• 2.2.1 植物中活性氧的种类及性质
• 2.2.2 植物体内活性氧的生成
• 2.2.3 盐胁迫下植物活性氧的清除
• 2.2.3.1 酶促保护系统
• 2.2.3.2 非酶促保护系统
• 2.3 转录因子与植物的抗逆性
• 2.3.1 转录因子的调控机制
• 2.3.1.1 组成型转录因子
• 2.3.1.2 诱导型转录因子
• 2.3.1.3 转录因子与植物抗逆性
• 2.3.2 转录因子YAP1 基因
• 3. 耐盐模式植物盐芥（Thellungiella halophila ）
• 4. 植物功能基因组学研究方法
• 5 激活标签法建立突变体库
• 5.1 激活标签法概述
• 5.2 激活标签法中的载体
• 5.2.1 T-DNA 的结构与功能
• 5.2.2 激活标签的质粒载体
• 5.3 获得T-DNA 插入位点侧翼序列的方法
• 5.3.1 质粒拯救法
• 5.3.2 反向PCR
• 5.3.3 TAIL PCR
• 5.3.3.1 TAIL-PCR 的基本原理
• 5.3.3.2 TAIL-PCR 的引物设计及反应条件
• 5.3.3.3 TAIL-PCR 的产物分析
• 5.3.3.4 TAIL-PCR 的优点以及技术难点
• 5.4 激活标签法在植物功能基因组学研究中的应用研究进展
• 5.5.1 标记基因的克隆
• 5.5.2 标记基因的功能鉴定
• 6. 建立盐芥激活标签突变体库的意义
• 第二部分 实验论文
• 第一章 盐芥激活标签突变体库的建立
• 1 实验材料
• 1.1 植物材料
• 1.2 菌种及质粒
• 1.3 酶及化学试剂
• 1.4 主要仪器设备
• 1.5 培养基
• 2. 实验方法
• 2.1 花浸染法转化盐芥
• 2.1.1 盐芥的种植
• 2.1.2 转化用农杆菌的准备
• 2.1.2.1 四个串联增强子的PCR 检测
• 2.1.2.2 转化用农杆菌菌液的制备
• 2.1.3 Floral dip 法转化盐芥
• 2.2 Basta 抗性苗的筛选
• 2.3 盐芥DNA 的提取
• 2.4 Basta 抗性苗的PCR 检测
• 2.5 TAIL-PCR 法扩增侧翼序列
• 2.5.1 引物设计
• 2.5.2 TAIL-PCR 反应体系
• 2.5.3 TAIL-PCR 反应程序
• 2.6 GeneClean 方法从琼脂糖凝胶上回收DNA 片段
• 2.7 PCR 产物与pMD18-T 载体的连接
• 2.8 大肠杆菌DH5α感受态细胞的制备和转化
• 2.9 质粒的提取及酶切验证
• 2.10 T-DNA 插入侧翼序列的测序及序列分析
• 2.11 激活标记突变体种子的收获与保存
• 3 实验结果及分析
• 3.1 激活标记载体四个串联增强子的PCR 检测
• 3.2 浸染用盐芥的种植
• 3.3 Basta 抗性苗的获得
• 3.4 Basta 抗性苗DNA 的提取
• 3.5 Basta 抗性苗的PCR 检测结果
• 3.6 侧翼序列的获得和分析
• 3.7 TAIL-PCR 扩增产物的酶切验证
• 3.8 盐芥激活标记侧翼序列的测序及序列分析
• 4 讨论:
• 4.1 关于盐芥的栽培
• 4.2 关于盐芥的转化效率问题
• 4.3 关于用除草剂Basta 对转基因种子的筛选
• 4.4 突变体侧翼序列的获得
• 4.5 突变体库的完善
• 第二章 YAP1 基因在拟南芥中的过量表达
• 1 实验材料
• 1.1 菌种
• 1.2 植物材料
• 1.3 质粒载体
• 1.4 酶及化学试剂
• 1.5 主要仪器设备
• 1.6 引物
• 2 实验方法
• 2.1 酿酒酵母总RNA 的提取
• 2.2 反转录PCR 扩增
• 2.3 PCR 产物与T 载体的连接
• 2.4 大肠杆菌感受态的制备及转化
• 2.5 质粒的提取
• 2.6 PCR 及酶切验证
• 2.7 测序验证
• 2.8 植物表达载体的构建及农杆菌的转化
• 2.9 农杆菌质粒的提取与鉴定
• 2.10 渗透法转化拟南芥
• 2.11 转基因植株的PCR 检测
• 2.12 转基因植株的Northern 杂交分析
• 2.12.1 异硫氰酸胍法提取总RNA
• 2.12.2 RNA 电泳
• 2.12.3 RNA 杂交膜的制备
• 2.12.4 Northern 杂交探针的制备
• 2.12.5 杂交过程
• 2.13 不同浓度NaCl 胁迫下转基因拟南芥各生理指标的测定
• 2.13.1 对照与转基因拟南芥在不同浓度NaCl 胁迫条件下的萌发率测定
• 2.13.2 对照与转基因拟南芥在不同浓度NaCl 胁迫条件下根生长速率测定
• 2.13.3 对照与转基因拟南界的NaCl 处理
• 2.13.4 对照与转基因拟南芥质膜相对透性的测定
• 2.13.5 对照与转基因拟南芥植株MDA 含量的测定
• 2.13.6 对照与转基因拟南芥植株光合水平的测定
• 2.13.7 对照与转基因拟南芥抗氧化保护酶SOD、POD、CAT、GR 及APX 活性的测定
• 2.13.8 过氧化氢含量的测定
• 3 结果与分析
• 3.1 转基因拟南芥转化子的筛选
• 3.2 转基因拟南芥的PCR 检测
• 3.3 转基因株系的 Northern 杂交分析
• 3.4 转基因拟南芥的耐盐性分析
• 3.4.1 对照及转YAP1 基因拟南芥在不同浓度NaCl 培养基上的萌发率
• 3.4.2 对照及转YAP1 基因拟南芥在不同浓度NaCl 培养基上根的相对生长速率
• 3.4.3 对照及转基因株系在不同浓度NaCl 胁迫条件下细胞膜相对透性的变化
• 3.4.4 不同NaCl 胁迫条件下对照及转基因拟南芥MDA 含量的变化
• 3.4.5 不同NaCl 胁迫条件下对照及转基因拟南芥PSⅡ最大光化学效率的变化
• 3.4.6 不同NaCl 胁迫条件下对照及转基因拟南芥H202 含量的影响
• 3.4.7 不同NaCl 胁迫条件下对照及转基因拟南芥抗氧化保护酶SOD、POD、CAT、APX、GST 及GR 活性的变化
• 3.4.7.1 SOD 活性的变化
• 3.4.7.2 POD 活性变化
• 3.4.7.3 CAT 活性的变化
• 3.4.7.4 APX 活性的变化
• 3.4.7.5 GST 活性变化
• 3.4.7.6 GR 活性变化
• 3.4.8 对照及YAP1 转基因拟南芥在不同浓度NaCl 胁迫下的生长情况
• 4 讨论
• 4.1 植物的盐害与活性氧
• 4.2 抗氧化保护酶的协同调节控制细胞内的氧化还原状态
• 4.3 转录因子与植物的抗盐性
• 4.4 导入YAP1 基因对拟南芥耐盐性的影响及其作用
• 参考文献
• 英文缩写符号及中英对照表
• 致谢
• 图版
• 攻读博士学位期间整理发表的论文