血管形成素样蛋白3在儿童原发性肾病综合征及足细胞损伤中的研究

论文摘要

前言原发性肾病综合征（NS）是儿童常见的肾脏疾病之一，以微小病变为主要的病理类型，大量蛋白尿、低蛋白血症、高度浮肿和高脂血症是该病最主要的临床表现，造成这一系列病理生理改变的关键是肾小球滤过屏障结构和功能的改变。近年来，研究者围绕着肾小球滤过屏障的功能障碍，特别是足细胞的损伤，深入探讨了参与蛋白尿发生的多种因素，包括足细胞的固有蛋白，如裂孔隔膜蛋白nephrin，细胞骨架蛋白α-actin等；以及足细胞合成分泌的功能性蛋白，如参与调节毛细血管通透性的血管形成因子，决定基底膜（GBM）电荷分布的perlecan、agrin等硫酸肝素样蛋白多糖（heparan sulfate proteoglycans，HSPGs）。这些足细胞表达的蛋白分子形成了复杂的足细胞分子网络，共同参与了蛋白尿的发生和进展。在该网络中研究者不断发现了许多重要的分子，并揭示了它们参与足细胞损伤及蛋白尿发生的机制。本课题组前期在微小病变肾病综合征患儿的肾组织中应用基因芯片技术对基因表达谱进行分析筛选，发现血管形成素样蛋白3（angiopoietin-like 3 protein，ANGPTL3）mRNA的表达水平高于正常儿童；随后在阿霉素肾病大鼠模型中应用激光微切割技术证实肾小球中ANGPTL3的表达随着蛋白尿加重而增高，其表达主要定位于足细胞。ANGPTL3属于血管形成素家族成员，主要由肝脏合成分泌，具有促进血管生成和调节脂质代谢的功能。但目前对它在肾脏疾病中的表达和作用尚无深入研究。本研究对ANGPTL3在儿童原发性肾病综合征肾组织中的表达，及其参与肾小球滤过屏障功能的变化进行初步探讨；同时，在体外培养的足细胞中分别通过嘌呤霉素诱导损伤，及基因转染高表达ANGPTL3，检测足细胞黏附功能改变及HSPGs表达变化，以进一步探讨ANGPTL3在足细胞损伤及蛋白尿发生中的作用机制。第一部分儿童原发性肾病综合征中肾组织ANGPTL3的表达目的研究ANGPTL3在不同病理类型的原发性肾病综合征患儿肾组织中的表达分布及其与蛋白尿的关系。方法（1）应用免疫组化的方法检测ANGPTL3和perlecan在不同病理类型的69例原发性肾病综合征及血尿患儿，包括微小病变（MCD）31例，膜性肾病（MN）6例，局灶节段性肾小球硬化（FSGS）6例，IgA肾病（系膜增生型）16例，薄基底膜肾病（TBMN）10例的肾组织，及2例正常对照肾组织中表达，并通过IMS彩色图像分析系统，将其量化为免疫组化指数。（2）ANGPTL3分别与WT1、perlecan进行双标记法免疫荧光染色。（3）在MCD患儿中将尿蛋白肌酐比值分别与ANGPTL3和perlecan在肾小球内染色强度及电镜下平均足突宽度（FWP）进行相关分析；并对不同发病年限分组的患儿肾小球ANGPTL3和perlecan的表达进行比较。结果（1）ANGPTL3在正常肾组织呈现微弱的沉积，而在不同病理类型的肾病综合征患儿肾组织的肾小球和肾小管中存在不同程度的表达。肾小球ANGPTL3的表达水平在MCD、MN中显著高于正常对照、TBMN及FSGS（均P＜0.05）。在IgA肾病中，蛋白尿组的肾小球ANGPTL3表达水平较单纯血尿组显著升高（P＜0.05），同时电镜下蛋白尿组中发生足突融合比例较高。（2）Perlecan在正常肾组织沿GBM及肾小管基膜分布，在MCD、FSGS的肾小球中表达显著减低，而在MN中沿增宽的GBM分布，表达显著升高。在IgA肾病中，蛋白尿组的肾小球perlecan表达水平较单纯血尿组显著减低（P＜0.05）。（3）荧光双标记染色显示ANGPTL3与基底膜标记物perlecan沿肾小球血管襻共定位表达，并主要在WT1染色的足细胞核周的胞浆分布。（4）MCD肾小球中ANGPTL3的免疫组化指数分别与尿蛋白肌酐比值及电镜下平均足突宽度正相关（相关系数r为0.86，0.84，P均＜0.05），并与肾小球perlecan的免疫组化指数负相关（r为-0.83，P＜0.05）。（5）不同发病年限的MCD患儿肾组织中肾小球ANGPTL3及perlecan的表达差异无显著性（P＞0.05）。小结在不同程度蛋白尿的患儿及不同足突融合程度的肾组织中存在ANGPTL3的表达差异。在MCD中，ANGPTL3主要在足细胞胞浆表达，肾小球中ANGPTL3的表达程度与蛋白尿程度及足细胞融合程度正相关。第二部分嘌呤霉素诱导足细胞损伤中ANGPTL3、perlecan及agrin的表达变化目的在体外嘌呤霉素诱导足细胞损伤模型中动态检测足细胞的ANGPTL3、perlecan及agrin表达变化，探讨ANGPTL3是否参与了足细胞的损伤应答过程。方法（1）建立体外条件永生化小鼠足细胞系（MPC5）培养；（2）在不同浓度（10mg／ml，20mg／ml，50mg／ml）的嘌呤霉素诱导损伤后，应用Western印迹、实时荧光定量PCR技术检测ANGPTL3在mRNA和蛋白水平的表达变化；（3）嘌呤霉素诱导足细胞损伤后48小时内，应用实时荧光定量PCR技术检测ANGPTL3、perlecan及agrin随嘌呤霉素作用时间延长而产生的表达水平变化。结果（1）在正常的足细胞中ANGPTL3的表达极其微弱；嘌呤霉素诱导浓度10ug／ml或20ug／ml下，足细胞表达ANGPTL3在mRNA水平及蛋白水平显著升高；嘌呤霉素诱导浓度50ug／ml时足细胞脱失死亡严重。（2）在嘌呤霉素诱导浓度10ug／ml下，从8h起出现perlecan和agrin的mRNA表达水平显著减低（分别46.6％、44.4％，P＜0.05）；随着嘌呤霉素作用时间延长，在24小时内呈现时间依赖性表达下调，并在作用24h达低谷（较对照组减低55.9％、74.8％），而在48h与24h表达水平差异无显著性。同时，ANGPTL3的mRNA表达水平从嘌呤霉素作用12h起才出现表达水平的显著升高（P＜0.05）；随着嘌呤霉素作用时间延长，在24小时内呈现时间依赖性表达上调，并在作用24小时达高峰（增高倍比8.16×103），而在48h较24h表达水平又有所减低（P＜0.05）。（3）嘌呤霉素诱导损伤24小时内ANGPTL3的表达水平分别与perlecan和agrin的表达水平呈负相关（相关系数分别为-0.407，-0.573，P分别为0.03，0.02）。小结在嘌呤霉素诱导足细胞损伤后，发现足细胞ANGPTL3表达升高发生在perlecan和agrin表达减低之后；足细胞在嘌呤霉素诱导损伤的24小时内ANGPTL3表达呈时间依赖性上调，伴随perlecan和agrin的时间依赖性表达下调，且ANGPTL3分别与perlecan和agrin的的表达水平呈负相关。第三部分ANGPTL3基因转染对足细胞perlecan和agrin表达的影响目的旨在运用基因转染技术在高表达ANGPTL3的足细胞中研究其参与嘌呤霉素诱导损伤的应答机制。方法（1）通过脂质体介导pcDNA3.1-ANGPTL3真核表达质粒转染体外培养的足细胞，并分别将细胞分为空白对照组，pcDNA3.1空载体转染组，嘌呤霉素诱导损伤组（诱导浓度10ug／ml），pcDNA3.1-ANGPTL3高表达质粒转染组，高表达质粒转染+嘌呤霉素诱导损害组。每组独立实验重复3次。（2）通过细胞免疫荧光法检测ANGPTL3和perlecan的在足细胞上表达分布；应用实时荧光定量PCR技术检测ANGPTL3、perlecan及agrin表达变化。（3）将空白对照组、空载体转染组及pcDNA3.1-ANGPTL3重组质粒转染组的足细胞，以嘌呤霉素（10ug／ml）诱导损伤，并通过贴壁细胞计数检测足细胞黏附率。结果（1）高表达ANGPTL3质粒转染足细胞48小时后，ANGPTL3的mRNA相对拷贝数较空白对照组升高8.18×103倍（P＜0.05）；同时perlean的相对拷贝数较空白对照组升高3.54（P＜0.05）；agrin的相对拷贝数较空白对照组升高1.22倍（P＜0.05）。通过免疫荧光检测发现足细胞上ANGPTL3、perlecan免疫荧光染色强度明显增强，且在足细胞胞浆呈共定位沉积。（2）高表达质粒pcDNA3.1-ANGPTL3转染后的足细胞（转染组）与正常足细胞（对照组）分别经嘌呤霉素诱导损害，发现ANGTPL3 mRNA相对拷贝数在转染组较对照组升高5.90倍（P＜0.05），但perlecan和agrin在转染组与对照组组间差异无显著性（P＞0.05），均较诱导损害前正常足细胞减低（均P＜0.05）。（3）正常足细胞或空载体转染足细胞组在嘌呤霉素诱导损伤24h足细胞黏附率分别为38.6％±4.7％，30.8％±7.5％；嘌呤霉素诱导损伤48h足细胞黏附率分别为27.4％±3.5％，20.6％±5.5％；而在pcDNA3.1-ANGPTL3转染后的足细胞组，其嘌呤霉素诱导损伤24h及48h的足细胞黏附率分别为95.7％±3.3％，80.6％±2.7％，较正常足细胞组及空载体转染足细胞组在嘌呤霉素诱导损伤时显著升高（均P＜0.05）。小结高表达ANGPTL3转染后足细胞可诱导perlecan、agrin的表达上调。高表达ANGPTL3的足细胞在嘌呤霉素诱导下，仍发生perlecan和agrin的表达减低，但嘌呤霉素诱导足细胞的失黏附现象得到明显改善。

论文目录

• 缩略语注释
• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 第一部分 儿童原发性肾病综合征中肾组织ANGPTL3的表达
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 小结
• 第二部分 嘌呤霉素诱导足细胞损伤中ANGPTL3、perlecan及agrin的表达变化
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 小结
• 第三部分 ANGPTL3基因转染对足细胞perlecan和agrin表达的影响
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 小结
• 结语和展望
• 参考文献
• 附录一:综述
• 附录二:在读期间撰写论文及获奖情况
• 致谢