结核分枝杆菌热休克蛋白Hsp16.3的表达、纯化及免疫学特性的初步研究

论文摘要

结核病（Tuberculosis,TB）是由结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis,MTB）所致以呼吸系统感染为主的慢性传染病。目前全球有1/3的人口被MTB感染,其中约10%的感染者可能发生TB,而剩余的绝大多数感染者以潜伏感染形式存在。MTB潜伏感染（latent tuberculosis infection,LTBI）是一种亚临床状态,此时细菌呈休眠状态。由于潜伏感染人群大,范围广,不易诊断,是目前导致TB爆发的一个重要因素。Hsp16.3（heat shock protein 16.3）是MTB的hspX基因（Rv2031c、acr）编码的蛋白,很多研究认为它的表达与MTB潜伏感染并形成休眠菌密切相关。研究表明Hsp16.3具有人和鼠的T淋巴细胞表位,是有效的亚单位疫苗的靶抗原。本研究旨在表达、纯化得到Hsp16.3后,并辅助佐剂研究其在小鼠体内诱发的免疫应答水平和保护力,同时选择Hsp16.3的T细胞表位合成肽作为对照,以期进一步了解Hsp16.3的免疫学特性,为TB新型疫苗的研究提供实验依据,为探索MTB进入休眠期和在休眠状态下存活的机制研究奠定物质基础,进而对寻找抑制MTB进入休眠期和杀灭MTB休眠菌的方法,对控制和根除TB具有重要意义。1. Hsp16.3的表达和纯化以MTB毒株H37Rv的DNA为模板,根据Genbank公布的MTB全基因组设计引物进行PCR,PCR产物核酸电泳鉴定后与经同样酶切的pTA2质粒连接,进行转化并筛选出阳性克隆,双向测序正确后命名为pTA2-Hsp16.3。将测序正确的Hsp16.3基因亚克隆入pPROEX HTb载体并诱导表达。分别用6×his的单克隆抗体（mAb）和Hsp16.3的mAb对表达产物进行Western blot分析,结果显示在相对分子量约16 kDa处均有特异性条带,与预计大小相吻合,表明成功表达目的蛋白。同时通过Western blot观察到表达的Hsp16.3不能与活动期TB病人血清形成特异条带。最后,采用Ni-NTA离子亲和柱纯化目的蛋白。2. Hsp16.3和Hsp16.3合成肽的免疫学特性研究选取BALB/c小鼠50只,随机分为五组（每组10只）,一组为Hsp16.3+二甲基双十八烷酸铵（dimethyl dioctadecylammonium bromide,DDA）+单磷酸脂质A（Monophosphoryl Lipid A,MPL）、一组为Hsp16.3合成肽+DDA+MPL,另一组为Hsp16.3合成肽+不完全弗氏佐剂（Freund’s Incomplete adjuvant, FIA）,一共免疫3次,每次间隔2周,同时设生理盐水组和BCG组作为对照。在免疫过程中分别于0、2、4、6、8周采血,将血清1:500稀释后,ELISA测血清中特异性抗体浓度,发现血清中抗Hsp16.3和抗Hsp16.3合成肽的抗体均呈迅速递增趋势,在免疫第4周后,增长趋于缓慢。末次免疫后4周,以Hsp16.3包被96孔板,测定各组平均抗体滴度,Hsp16.3+DDA+MPL组为1:3000,Hsp16.3合成肽+DDA+MPL组和Hsp16.3+FIA组均为1:1500,BCG组为1:500,生理盐水组为1:100,3个实验组的特异性抗体滴度显著高于BCG组的（P <0.01）;以Hsp16.3合成肽包被96孔板,测定各组平均抗体滴度,Hsp16.3+DDA+MPL组和Hsp16.3合成肽+DDA+MPL组为1:2000, Hsp16.3合成肽+FIA组为1:1000,BCG组为1:500,生理盐水组为1:100,3个实验组的特异性抗体滴度也显著高于BCG组的（P <0.05）。末次免疫4周后,分离每组5只免疫小鼠的脾淋巴细胞,用Hsp16.3和Hsp16.3合成肽分别进行刺激,MTT法检测淋巴细胞增殖,ELISA法检测细胞因子IFN-γ的水平。结果显示,Hsp16.3+DDA+MPL组、Hsp16.3合成肽+DDA+MPL组、Hsp16.3合成肽+FIA组小鼠的脾淋巴细胞经Hsp16.3和Hsp16.3合成肽分别刺激后,其平均刺激指数均高于BCG组的（P <0.05）,并显著高于生理盐水组的（P <0.01）,表明3个实验组小鼠脾淋巴细胞经刺激后均能发生明显的特异性增殖。当用Hsp16.3刺激时,Hsp16.3+DDA+MPL组和Hsp16.3合成肽+DDA+MPL组的刺激指数高于Hsp16.3合成肽+FIA组（P <0.05）;当用Hsp16.3合成肽刺激时,Hsp16.3合成肽+DDA+MPL组大于Hsp16.3+DDA+MPL组的（P <0.05）,Hsp16.3合成肽+DDA+MPL组和Hsp16.3合成肽+FIA组之间无差异（P >0.05）。经Hsp16.3和Hsp16.3合成肽分别刺激后, Hsp16.3+DDA+MPL组、Hsp16.3合成肽+DDA+MPL组和Hsp16.3合成肽+FIA组免疫小鼠的脾淋巴细胞诱生的IFN-γ水平均高于生理盐水组的（P <0.01）,但低于BCG组（P <0.01）。当用Hsp16.3刺激时,3个实验组的IFN-γ水平均无差异（P >0.05）;而当用Hsp16.3合成肽刺激时,Hsp16.3合成肽+DDA+MPL组的IFN-γ水平高于Hsp16.3+DDA+MPL组和Hsp16.3合成肽+FIA组的（P<0.05）。各组其余的5只免疫小鼠用MTB毒株H37Rv经尾静脉注射感染。4周后,脱颈处死小鼠,无菌条件下进行脾脏匀浆,倍比稀释后接种于7H10平板,37℃培养3～4周,计数细菌菌落形成单位（cloning forming units,CFU）,以观察免疫小鼠对MTB毒株攻击的抵抗作用。结果表明,与生理盐水组相比,3个实验组和BCG组对MTB在脾脏中的增殖均有抵抗作用（P <0.05）;但与BCG组相比,3个实验组对MTB在脾脏中增殖的抵抗作用不如BCG组（P >0.05）。3.结论在大肠杆菌表达系统中成功表达并纯化出Hsp16.3,该蛋白能够与Hsp16.3的mAb发生特异性反应,表明具有一定的生物活性。免疫小鼠后的实验结果显示:Hsp16.3和Hsp16.3合成肽均能诱发的一定水平的细胞免疫应答和体液免疫应答,并产生一定的免疫保护力,可以抵御MTB的感染。Hsp16.3合成肽+DDA+MPL诱导的免疫应答水平和保护力均优于Hsp16.3合成肽+FIA,表明佐剂的选择对免疫结果有一定的影响,即DDA+MPL优于FIA。与Hsp16.3合成肽相比,Hsp16.3诱导的体液免疫更强烈,但淋巴细胞增殖指数,INF-γ释放水平及对MTB毒株H37Rv的抵抗力均弱于其合成肽（差异不显著）。可见,在一定免疫学共性的基础上二者各有优势,提示Hsp16.3和Hsp16.3合成肽均有望成为TB疫苗的候选组分。

论文目录

• 缩略语表
• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 文献回顾
• 正文
• 实验一 结核分枝杆菌热休克蛋白Hsp16.3 的表达和纯化
• 1 材料
• 2 方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 实验二 Hsp16.3 和Hsp16.3 合成肽的免疫学特性研究
• 1 材料
• 2 方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 小结
• 参考文献
• 附录
• 个人简历和研究成果
• 致谢