论文摘要
近年来,临床药理研究证明,许多中药材如决明子、大黄、何首乌、泽泻、银杏叶等都具有降低血脂的功能。利用这些中药材所制成的复方制剂在临床上也得到了广泛的应用。降脂类中药复方制剂是基于天然中药材及中医理论研究开发出的药品,它不仅能明显降低血清中胆固醇、甘油三酯的含量,还能大大降低冠心病和脑血管病的发生率及死亡率,提高机体抗氧化等能力。在临床上,治疗心脑血管疾病的西药一般采用他汀类、烟酸类、苯氧酸类、多烯脂肪酸类等治疗,虽然疗效确切,但经常会引起头痛、眩晕、恶心、腹泻、腹胀、皮疹等不良反应。与西药相比中药制剂的降脂作用虽然缓慢,但安全系数高,功效全面、疗效确切,无明显的毒副作用。研究还证实,降脂类中药制剂除有降脂作用外,还能减缓或终止动脉粥样硬化的过程,经长期服用可取得良好的治疗效果。为了使降脂中药复方制剂得到安全、广泛的应用,对其指标成分的质量控制就成为我们研究的主要对象。药品质量的可控性是药品的基本属性,是药品的安全性和有效性的基础。质量标准是控制药品质量的重要手段,能有效的控制药品的质量,确保用药的安全,是质量可控性的具体体现。本课题选用降脂宁颗粒、脂降宁片、消渴灵片中的指标成分作为研究对象,采用反相高效液相色谱法和高效毛细管电泳法对复方制剂中指标成分的质量控制进行较为系统的方法学研究。所建立的方法专属性强、精密度和稳定性良好,实验结果准确可靠,可为降脂中药复方制剂的质量控制提供科学、有效的试验方法与依据。第一部分反相高效液相色谱法测定降脂宁颗粒中二苯乙烯苷、橙黄决明素、大黄素和大黄素甲醚的含量目的:建立反相高效液相色谱法同时测定降脂宁颗粒中二苯乙烯苷、橙黄决明素、大黄素和大黄素甲醚的含量测定方法,为降脂宁颗粒的质量控制提供依据。方法:1提取方法:选用不同提取溶剂和不同提取时间来提高降脂宁颗粒指标成分的提取效率的方法。2反相高效液相色潽法的优化条件：选择合适的流动相缓冲系统，调整流动相的组成、配比、流速以及柱温,在最大吸收波长下测定,使指标峰与其它峰得到完全分离。3系统适应性试验:在确定的提取方法和色谱条件下,考察4种被测组分的分离度、理论塔板数、对称因子等是否符合要求。4方法学的考察:标准曲线的绘制、最低检测限试验、精密度试验、重复性试验、稳定性试验、回收率试验。5样品含量测定:取4批降脂宁颗粒样品制备成供试品溶液,测定各批样品中四种指标成分的含量。结果:1提取方法:以75%甲醇为提取溶剂,30 min为最佳超声时间来制备供试品溶液,使各组分的提取率达到最大。2反相高效液相色潽法的条件：采用DiamonsilTM C18（150 mm×4.6 mm,5μm）色谱柱;0.1%磷酸溶液（A）-甲醇（D）作为流动相;洗脱条件:05 min 75%A,515 min 60%A,1525 min 50%A,2530 min 20%A,3040 min 10%A;流速为1.0 mL/min;检测波长是286 nm;柱温25℃;进样量20μL。3系统适应性试验:二苯乙烯苷、橙黄决明素、大黄素和大黄素甲醚峰形良好,无其它峰干扰,其理论塔板数均大于5000,与相邻色谱峰的分离度均大于1.5。4方法学的考察:二苯乙烯苷、橙黄决明素、大黄素和大黄素甲醚分别在0.5804.06μg、0.2191.32μg、0.05400.324μg、0.1861.12μg,范围内有良好的线性关系,回归方程分别为:A=2.06×103c-5.60（r=0.9998）、A=1.36×103c-5.49 （ r=0.9998 ）、A=7.24×102c-2.27 （ r=0.9995 ）、A=8.53×103c-20.5（r=0.9997）;该方法精密度试验的RSD值分别为0.94%、1.8%、1.7%、1.9%;重复性试验的RSD值分别为1.3%、1.2%、0.76%、2.0%;12小时内稳定性的RSD分别为1.9%、2.7%、1.4%、2.6%;平均回收率分别为96.2%、96.1%、96.6%、97.7%,RSD分别为0.74%、1.0%、3.1%、2.6%（n=5）。5含量测定:在所建立的色谱条件下,对不同批次的降脂宁颗粒中四种指标成分的含量进行同时测定,再用外标法计算样品各成分的含量。结论:该方法准确、方便、灵敏度高、稳定性好,可作为降脂宁颗粒中二苯乙烯苷、橙黄决明素、大黄素和大黄素甲醚的含量测定方法。该方法也为降脂宁颗粒的质量控制提供了依据。第二部分脂降宁片中丹参素、绿原酸、葛根素、二苯乙烯苷和橙黄决明素的HPLC法测定目的:建立了HPLC法同时测定脂降宁片中的五种指标成分-丹参素、绿原酸、葛根素、二苯乙烯苷和橙黄决明素。为该制剂的质量控制提供参考。方法:1提取方法:对供试品溶液进行回流提取和超声提取,并对这两种提取方法进行比较,选择提取效率较高的方法。2反相高效液相色潽法的优化条件：选用合适的色谱柱及检测波长，调整流动相的组成、配比、以及流速和柱温。3系统适应性试验:在已确定的提取方法和色谱条件下,考察5种被测组分的分离度、理论塔板数、对称因子等是否符合要求。4方法学的考察:制作标准曲线、最低检测限试验、精密度试验、重复性试验、稳定性试验、回收率试验。5含量测定:取不同批次的脂降宁片,测定各批次中五种指标成分的含量。结果:1提取方法:以75%甲醇为提取溶剂,30 min为最佳超声时间来制备供试品溶液,可使各组分的提取率达到最大。2色潽条件的优化：采用Kromasil C18（150 mm×4.6 mm,5μm）色谱柱;以0.1%磷酸溶液-甲醇-乙腈为流动相,梯度洗脱,检测波长是286 nm;柱温25℃;进样量为10μL。3系统适应性试验:丹参素、绿原酸、葛根素、二苯乙烯苷和橙黄决明素峰形良好,无其它峰干扰,其理论塔板数均大于5000,与相邻色谱峰的分离度均大于1.5。4方法学验证:丹参素、绿原酸、葛根素、二苯乙烯苷和橙黄决明素分别在4.931.58×102μg/mL、1.394.44×102μg/mL、8.082.59×102μg/mL、4.531.45×102μg/mL和1.103.52×102μg/mL浓度范围内线性关系良好,回归方程分别为:A=7.01×102c-0.310（r=0.9998）、A=4.29×103c+0.0725（r=0.9997）、A=3.11×103c+0.760（r=0.9998）、A=1.74×103c-1.43（r=0.9997）、A=44.02×103c-1.1（1r=0.9996）;该方法精密度试验的RSD值分别为0.41%、0.74%、0.66%、0.83%和1.3%;重复性试验的RSD值分别为0.56%、0.71%、0.96%、1.2%和1.9%;12小时内稳定性的RSD分别为1.1%、1.8%、0.95%、1.6%和2.1%;平均回收率分别为96.5%、98.2%、97.2%、95.9%和96.0%,RSD分别为0.94%、1.6%、0.68%、2.0%和0.72%（n=5）。5含量测定:对不同批次的脂降宁片中五种指标成分的含量进行测定之后,再用外标法计算各样品指标成分的含量。结论:本文建立了反相高效液相色潽法测定脂降宁片中丹参素、绿原酸、葛根素、二苯乙烯苷和橙黄决明素的含量测定方法。该方法准确、方便、灵敏度高为脂降宁片的质量控制提供了依据,为保证中药复方制剂的质量提供良好的质控方法。第三部分胶束电动毛细管电泳法同时测定脂降宁片中葛根素、丹酚酸B和丹参素的含量目的:建立可以同时测定脂降宁片中葛根素、丹酚酸B和丹参素的含量的胶束电动毛细管电泳法。方法:1提取条件:采用回流提取和超声提取两种方法,比较样品中指标成分的含量,选择提取率较高的方法。2电泳条件:采用未涂层石英毛细管（50.2 cm×75μm×40 cm）为分离柱,80 mmoL/L磷酸二氢钠-8 mmoL/L-十二烷基硫酸钠（SDS）-10%乙腈（pH为6.30）为运行缓冲液,重力进样5 s（0.5 Psi）,在分离电压20 kV、温度22℃、紫外检测波长为214 nm时,对脂降宁片中葛根素、丹酚酸B和丹参素进行分离测定,同时考察影响各组分分离效果的因素。3系统适应性试验:在已确定的提取方法和电泳条件下,考察被测组分的分离度和迁移时间等。4方法学的考察:制作标准曲线、最低检测限试验、精密度试验、稳定性试验、回收率试验。5含量测定:取三批次的脂降宁片制备成供试品溶液,测定其三种指标成分的含量。结果:1本试验建立了胶束电动毛细管电泳法同时测定脂降宁片中葛根素、丹酚酸B和丹参素的方法。三种组分能在20 min内全部实现基线分离。2三组分分别在18.02.89×102μg/mL、3.2351.7μg/mL、19.73.14×102μg/mL浓度范围内与峰面积呈良好的线性关系,线性方程分别为:A=6.18×105c+56.8 （ r=0.9999 ）、A=1.19×106c+49.0 （ r=1.000 ）、A=9.21×105c-75.2（r=0.9999）;精密度试验的RSD值为2.3%、1.4%、3.2%;稳定性试验的RSD为1.2%、2.6%、2.5%;样品的平均回收率为97.5%、97.8%、97.1%,RSD值分别为1.5%、2.2%、1.9%。结论:该方法简单、快速、回收率高、试验成本低,为脂降宁片的质量控制提供了有力依据,同时也为中药复方制剂的毛细管电泳测定提供了参考。第四部分反相高效液相色谱法测定消渴灵片中盐酸小檗碱的含量目的:采用反相高效液相色谱法测定消渴灵片中盐酸小檗碱的含量方法:1提取方法:以75%甲醇为提取溶剂,25 min为最佳超声时间来制备供试品溶液,使盐酸小檗碱的提取效率达到最高。2色潽条件的优化：采用DiamonsilTM C18（250 mm×4.6 mm,5μm）色谱柱;以0.1%磷酸（A）-甲醇（B）为流动相,梯度洗脱条件为010 min 90%A,1025 min 70%A,2540 min 40%A,4045 min 10%A;检测波长是265 nm;柱温25℃;进样量为10μL。3系统适应性试验:在已确定的提取方法和色谱条件下,考察被测组分的分离度、理论塔板数、对称因子等是否符合要求。4方法学的考察:制作标准曲线、最低检测限试验、精密度试验、重复性试验、稳定性试验、回收率试验。（5）含量测定:取三批次的消渴灵片制备供试品溶液,测定盐酸小檗碱的含量。结果:1系统适应性试验:盐酸小檗碱的峰形良好,无其它干扰峰,其理论塔板数大于10000,与相邻色谱峰的分离度大于1.5。2方法学的考察:盐酸小檗碱在0.0268～0.429 mg/mL范围内线性关系良好,回归方程为:A=9.70×103c+3.14（r=0.9999）;该方法精密度试验的RSD值为0.76%;重复性试验的RSD值为0.38%;24小时内稳定性的RSD为0.62%;平均回收率为98.2%,RSD为1.4%（n=5）。3含量测定:三批次中盐酸小檗碱的平均含量分别为4.78 mg/g、4.47 mg/g、4.86 mg/g。结论:本文建立了反相高效液相色潽法测定消渴灵片中盐酸小檗碱的含量测定方法。该组分分离效果好,测定简便,为该制剂的质量综合评价提供准确、快速的定量方法。
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