洛旱2号小麦中4个干旱诱导基因的克隆和表达

论文摘要

本文在分析干旱胁迫条件下小麦品种洛旱2号根系基因表达谱的基础上,通过RT-PCR技术克隆了4个干旱胁迫反应相关基因,分析了克隆基因在干旱、高盐胁迫和ABA处理条件下的表达特性;构建了其中一个基因TaLEA4的正义和反义植物表达载体,并通过基因枪法、花粉管通道法和农杆菌介导法进行了小麦和水稻的遗传转化,获得了经PCR鉴定呈阳性的转基因植株。主要结论为:1.利用RT-PCR方法克隆了小麦干旱胁迫反应相关基因4个:克隆基因TaLEA4的cDNA片段为764bp,编码区为510 bp,5’-非编码区有94bp,3’-非编码区有160 bp,推测编码蛋白的分子量为17.53 kD,由169个氨基酸组成,进一步研究发现克隆基因TaLEA4在中国春基因组中包含一个100bp的内含子。TaRAB12基因cDNA片段长度为1013bp,其中编码区696bp,推测编码蛋白由231个氨基酸组成,分子量为23.14 kD;TaRAB56基因的cDNA片段长度为464bp,编码区为363bp,推测可编码120个氨基酸的多肽;TaRAB910基因的cDNA片段为950bp,其中编码区为549bp,可编码182个氨基酸的多肽,进一步分析发现该基因为受水分胁迫调控的膜蛋白基因。2.分析了克隆基因在干旱和高盐（NaCl）胁迫及ABA处理条件下的表达特性。结果表明,在小麦幼苗根系中,在PEG6000胁迫诱导前期,TaLEA4基因的表达量逐渐上升,24h达到最强,48h时迅速回落;而在小麦幼苗的叶片中,该基因的在水分胁迫0.5h的表达量较强,其它时间点的表达水平都较低;在ABA处理胁迫条件下,该基因也表现出差异表达的特性。PEG胁迫条件下,小麦洛旱2号叶片中TaRAB56基因的表达呈现出逐渐增强后减弱的趋势,根系中TaRAB56基因在处理6h时有稍强于对照的表达;中国春叶片和根系中TaRAB56基因在胁迫不同时期的表达量与对照相比有较大差异。NaCl处理条件下,该基因在小麦洛旱2号中仅在0.5h时有稍强于对照的表达,而在中国春叶片和根系中该基因表达趋势不明显;在ABA胁迫过程中,TaRAB910基因在小麦幼苗叶片中出现了差异表达;但在NaCl胁迫过程中,该基因在根系中的表达量高于在叶片中的表达量。3.构建了TaLEA4基因的正义和反义植物表达的载体,并通过基因枪、花粉管通道和农杆菌介导法分别进行了小麦和水稻的遗传转化研究。转基因植株的PCR检测结果表明:基因枪法获得转TaLEA4正义基因的转基因小麦阳性植株2株,转TaLEA4反义基因的转基因小麦阳性植株6株;花粉管通道法获得转反义TaLEA4基因小麦植株223株（其中以郑麦9023为受体的185株,以豫麦34为受体的38株）,转正义TaLEA4基因小麦植株26株（其中以郑麦9023为受体的5株,以豫麦34为受体的21株）;农杆菌介导法获得转基因水稻植株20株,其中转正义和反义TaLEA4基因的植株分别为4株和16株。

论文目录

• 致谢
• 中文摘要
• 1 文献综述
• 1.1 植物对干旱胁迫应答机制研究
• 1.2 植物抗旱性的生理调节机制
• 1.2.1 干旱与植物气孔运动
• 1.2.2 干旱与植物代谢的关系
• 1.2.3 渗透调节
• 1.2.4 功能蛋白的调节
• 1.2.5 抗氧化防御系统
• 1.2.6 可溶性糖保护
• 1.3 植物干旱胁迫信号的转导机制
• 1.3.1 干旱胁迫信号的感受
• 1.3.2 干旱胁迫信号的传递
• 1.3.3 干旱胁迫诱导的基因表达及转录调控
• 1.4 小麦抗旱基因的遗传转化研究进展及转基因作物的安全性分析
• 1.4.1 小麦遗传转化的主要方法
• 1.4.2 各种转化方法的应用前景展望
• 1.4.3 转基因作物的生物安全性
• 1.5 后期胚胎发生丰富蛋白研究进展
• 1.5.1 LEA 蛋白的性质
• 1.5.2 LEA 蛋白的分类和结构
• 1.5.3 LEA 蛋白的生物学功能研究
• 1.6 小麦抗旱基因工程存在问题及解决途径
• 2 引言
• 3 材料与方法
• 3.1 实验材料
• 3.1.1 植物材料和菌株
• 3.1.2 质粒载体
• 3.1.3 工具酶及试剂盒
• 3.1.4 主要仪器
• 3.1.5 PCR 引物
• 3.1.6 常用培养基
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 总 RNA 提取及质量鉴定
• 3.2.2 总 RNA 的纯化
• 3.2.3 目的基因的克隆
• 3.2.4 cDNA 的获得及基因表达特性分析
• 3.2.5 TaLEA4 正义和反义基因植物表达植物表达载体的构建
• 3.2.6 基因枪法遗传转化
• 3.2.7 花粉管通道法遗传转化
• 3.2.8 农杆菌介导法转化基因
• 4. 结果和分析
• 4.1 小麦根系中水分胁迫相关基因的克隆
• 4.1.1 RNA 质量检测及第一链的获得
• 4.1.2 TaLEA4 的克隆及序列分析
• 4.1.3 TaRAB12 的克隆及序列分析
• 4.1.4 TaRAB56 的克隆及序列分析
• 4.1.5 TaRAB910 的克隆及序列分析
• 4.2 克隆基因的表达特性分析
• 4.2.1 胁迫不同时期及其对照总 RNA 的提取
• 4.2.2 TaLEA4 克隆基因在不同胁迫条件下的表达特性分析
• 4.2.3 TaRAB56 基因在20%PEG6000 处理的小麦洛旱2 号和中国春中的表达分析
• 4.2.4 TaRAB910 基因在100uM ABA 处理的小麦洛旱2 号和中国春中的表达分析
• 4.2.5 TaRAB910 基因在150uM NaCl 处理后小麦洛旱2 号和中国春中的表达分析
• 4.3 TaLEA4 基因植物表达载体的构建及遗传转化
• 4.3.1 TaLEA4 过表达和抑制表达植物表达载体的构建
• 4.3.2 基因枪法遗传转化小麦 TaLEA4 植物表达载体阳性植株的获得和鉴定
• 4.3.3 花粉管通道法遗传转化小麦 TaLEA4 过表达和抑制表达阳性植株的获得和鉴定
• 4.3.4 农杆菌介导法遗传转化水稻阳性植株的获得和 PCR 检测
• 5 结论与讨论
• 5.1 干旱胁迫下小麦根系中基因克隆和基因组结构分析
• 5.2 克隆基因表达特性分析和抗旱分子机理探讨
• 5.3 TaLEA4 过量和抑制表达基因在小麦和水稻中的遗传转化研究
• 参考文献
• 英文摘要