番木瓜环斑病毒胶体金免疫层析试纸的研制

论文摘要

番木瓜环斑病毒（Payaya ringspot virus,PRSV）属于马铃薯Y病毒属（Potyviruses）,是严重限制番木瓜大面积生产的因素之一,番木瓜一旦受到此病毒的侵染,便很难防治,损失惨重。鉴于此,本文旨在研制能够在田间快速检测番木瓜环斑病毒的胶体金免疫层析试剂条,以便能够对田间病株进行早期判断,做好防治工作,减少经济损失。本文通过一系列鉴别寄主和PRSV-CP的核苷酸序列和氨基酸序列的同源性比较,将采自发病番木瓜上的病毒鉴定为PRSV-Vb株系。采用摩擦接种将南瓜上的PRSV-Vb株系接种于系统感染寄主西葫芦上,以CCl4-CHCl3为澄清剂,PEG沉淀和超速离心初步提取发病西葫芦叶片中的PRSV,用30%蔗糖硫酸铯梯度离心精提纯PRSV颗粒,然后以提纯的病毒为抗原免疫新西兰大白兔,获得高效价的PRSV抗血清。对制备的PRSV抗血清采用辛酸硫酸铵法和Protein A柱亲和层析法进行纯化,纯化后的抗血清用吸光度、间接ELISA和SDS-PAGE对其中的免疫球蛋白的浓度、纯度及效价进行测定。采用柠檬酸钠法制备胶体金颗粒,选择18 nm的胶体金颗粒标记PRSV抗体；胶体金的标记条件为蛋白浓度18μg/mL,最佳pH约为7.5（0.2 M K2CO3 15 μL/mL）;PRSV胶体金探针稀释度为1：3,喷涂15μL于金标结合垫上；兔抗PRSV抗体和羊抗兔抗体的适合点样浓度为1.6 mg/mL和0.5 mg/mL。经比较,选择Ahlstrom8964作为金标结合垫,Millipore 135为层析膜,SB06为样品垫,吸水纸选择SX18。制作的胶体金免疫层析试纸条能够在10 min中内出现明显的条带,病汁液稀释1000倍仍可检测到,检测结果与ELISA检测结果相一致。PRSV胶体金免疫层析试纸条经实验证明,该试纸条能够快速、稳定地检测PRSV,具有特异性强,操作简单,可用于田间PRSV的快速检测。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 1 前言
• 1.1 番木瓜环斑病毒研究进展
• 1.1.1 番木瓜环斑病毒的发生与危害
• 1.1.2 PRSV的株系和症状
• 1.1.3 PRSV病毒粒子
• 1.1.4 PRSV寄主和传播途径
• 1.1.5 番木瓜环斑病毒病的防治
• 1.2 植物病毒的检测方法
• 1.2.1 生物学方法
• 1.2.2 电子显微镜
• 1.2.3 免疫学方法
• 1.2.4 免疫胶体金标记法
• 1.3 本项目的研究目的和意义
• 2 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 实验药品
• 2.1.2 供试毒源,供试寄主
• 2.1.3 引物设计
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 生物学方法鉴定番木瓜环斑病毒株系
• 2.2.2 分子生物学鉴定番木瓜环斑病毒株系
• 2.3 PRSV纯化
• 2.3.1 PRSV粗提纯
• 2.3.2 PRSV精提纯
• 2.3.3 提纯病毒的吸光值测定
• 2.3.4 电镜观察
• 2.3.5 病毒的外壳蛋白的SDS-PAGE
• 2.4 PRSV抗血清的制备
• 2.4.1 PRSV免疫新西兰大白兔
• 2.4.2 PRSV抗血清效价测定
• 2.4.3 颈动脉取血
• 2.4.4 PRSV最适工作浓度的确定
• 2.5 PRSV抗体的纯化
• 2.5.1 辛酸-硫酸铵纯化抗体
• 2.5.2 Protein A柱亲和纯化PRSV抗体
• 2.5.3 纯化抗体浓度测定
• 2.5.4 抗体纯度鉴定
• 2.5.5 间接ELISA测定IgG效价
• 2.6 胶体金免疫层析试纸条的制备
• 2.6.1 器皿的处理
• 2.6.2 柠檬酸钠法还原制备胶体金
• 2.6.3 胶体金质量鉴定
• 2.6.4 金标抗体的制备与纯化
• 2.6.5 胶体金探针的质量鉴定
• 2.6.6 胶体金标记抗体条件的优化
• 2.6.7 试纸条材料的选择
• 2.6.8 组装试纸条
• 2.6.9 试纸条的检测方法和结果判断
• 2.6.10 试纸条的性能测试
• 3 结果与分析
• 3.1 生物学方法鉴定番木瓜环斑病毒株系
• 3.2 分子生物学方法鉴定番木瓜环斑病毒株系
• 3.2.1 提取的总RNA质量的鉴定
• 3.2.2 目的片段的扩增
• 3.2.3 重组克隆载体的构建及鉴定
• 3.2.4 PRSV-CP基因序列的测定及其同源性的比较
• 3.3 PRSV的提纯与抗血清的制备
• 3.3.1 30%蔗糖硫酸铯精提纯PRSV
• 3.3.2 提纯PRSV粒体电镜观察
• 3.3.3 提纯PRSV病毒的紫外吸收
• 3.3.4 提纯病毒蛋白电泳
• 3.3.5 抗血清效价的测定
• 3.3.6 最适合工作浓度确定
• 3.4 PRSV抗体纯化检测结果
• 3.5 胶体金免疫层析试纸条的制备
• 3.5.1 胶体金的制备
• 3.5.2 胶体金标记抗体制备及质量鉴定
• 3.5.2.2 最佳标记蛋白量确定
• 3.5.3 胶体金标记探针、检测线抗体、质控线抗体工作浓度的确定
• 3.5.4 试纸条材料的选择
• 3.5.5 胶体金试纸条的组装与测试
• 3.5.6 胶体金试纸条性能测试
• 4 讨论
• 4.1 番木瓜环斑病毒株系的鉴定
• 4.2 PRSV纯化
• 4.3 抗体的纯化方式
• 4.4 胶体金的选择
• 4.5 胶体金标记条件的优化
• 4.6 上样的方式
• 总结
• 参考文献
• 致谢