论文摘要
背景：多发性骨髓瘤（multiple myeloma，MM）是一种来源于浆细胞的血液系统恶性肿瘤，它的发生率在血液系统肿瘤中居第二位[1]。MM的发病机制尚不清楚，目前骨髓微环境中细胞因子与骨髓瘤生长的关系是研究的热点，已发现白细胞介素-6（IL-6）、肿瘤坏死因子（TNF）、肝细胞生长因子（HGF）、血管内皮生长因子（VEGF）、白细胞介素-10（IL-10）、白细胞介素-21（IL-21）等细胞因子在骨髓瘤细胞的增殖、抗凋亡和耐药性产生等方面起了很重要的作用[2-5],它们通过作用于特异的受体再活化JAK/STAT3、PI-3激酶/AKT、Ras/MAPK、NF-κB、β-catenin旁路等几种信号转导通路，导致骨髓瘤细胞增殖。我们课题组在利用BALB/c小鼠的骨髓瘤细胞SP2/0和受免疫BALB/c小鼠的B淋巴细胞融合而成的杂交瘤细胞制备抗人肝再生增强因子（Augmenter of Liver Regeneration,ALR）单抗时偶然发现：将能产生抗人ALR单抗的杂交瘤细胞注射入BALB/c小鼠腹腔内，从而产生含高浓度抗人ALR单抗的腹水，我们进行了多次制备，每次五只小鼠，然而让人惊奇的是，每次总有2-3只小鼠在产生1-2轮腹水后，腹水自行消失，开腹检查找不到任何接种杂交瘤细胞的痕迹。由此我们推测，骨髓瘤细胞可能产生和分泌大量ALR，并且严重依赖ALR来维持其恶性生长，由于小鼠的B淋巴细胞产生的抗人ALR单抗中和了骨髓瘤细胞增殖依赖的ALR，导致骨髓瘤细胞缺乏维持其恶性生长的刺激信号而发生凋亡，最终腹水自行消失。肝再生增强因子是上世纪90年代初被克隆的一种新的热稳定性、非特异性促进损伤肝脏修复的细胞因子，分子量约为15KD，其氨基酸序列和分子结构均不同于肝细胞生长因子（HGF），它在体内多种组织器官中有表达[6]。目前对它的生物学作用研究主要局限于肝脏。我们课题组前期实验发现，ALR在体外能刺激肝癌细胞的增殖，且其促增殖效应与ALR的浓度成正相关，但是ALR对原代肝细胞的增殖无刺激作用[7、8]。实验证明ALR在肝癌组织中是高表达的，而正常成人大多数肝细胞均不表达ALR[9、10]，这些都提示ALR在肝癌的发生、发展中起了重要作用。我们课题组最新的研究（基金资助项目：30570826）也证明用ALR特异性单抗阻断肝癌细胞分泌的ALR与其受体结合或用siRNA在转录水平阻止ALR表达，均能明显抑制肝癌细胞增殖和移植瘤的生长[11、12]。关于ALR在多发性骨髓瘤中的表达及其在多发性骨髓瘤增殖中的作用，目前国内外尚无任何研究报道。因此，我们以此为切入点，针对以上ALR是否参与多发性骨髓瘤发生、发展的作用进行研究，以期阐明ALR在多发性骨髓瘤发生、发展中的作用和机制，并为多发性骨髓瘤的治疗提供新的参考靶点和实验依据。本研究主要分为三个部分：第一部分：ALR在人多发性骨髓瘤细胞株U266中的表达研究。目的：通过对人多发性骨髓瘤细胞株U266中ALR的mRNA和蛋白水平的检测，证明多发性骨髓瘤细胞高表达ALR，为进一步探讨ALR在多发性骨髓瘤细胞增殖中的作用奠定基础。方法：利用Realtime PCR检测人多发性骨髓瘤细胞株U266、小鼠骨髓瘤细胞株SP2/0及正常人外周血单个核细胞PMBC中ALR的mRNA表达水平；利用Western-blot检测U266、SP2/0及PMBC细胞中ALR的蛋白表达水平。结果：Realtime PCR结果显示人多发性骨髓瘤细胞株U266和小鼠骨髓瘤细胞株SP2/0中ALR的mRNA表达水平明显高于正常人外周血单个核细胞PMBC。Western-blot结果显示U266、SP2/0细胞株中ALR蛋白表达水平较高，而PMBC组未见ALR蛋白表达。结论：在多发性骨髓瘤细胞株U266中，ALR mRNA及蛋白水平均为高表达。第二部分：ALR对人多发性骨髓瘤细胞株U266增殖及凋亡的影响研究。目的：检测外源性加入ALR及抗ALR单克隆抗体后U266细胞增殖情况；构建表达ALR基因的shRNA干扰慢病毒，检测沉默内源性ALR后U266细胞增殖及凋亡情况。方法：利用台盼蓝染色初步观察U266细胞株在分别加入外源性ALR和ALR单克隆抗体后的增殖情况，然后利用MTS法检测不同浓度的ALR和ALR单抗对U266细胞株增殖的影响。接下来，构建表达ALR shRNA干扰慢病毒，感染U266细胞株，在荧光显微镜下通过绿色荧光蛋白（GFP）观察感染效率，Real-time PCR检测U266细胞株ALR mRNA水平，Western blot检测U266细胞株ALR蛋白水平，观察干扰效率。通过台盼蓝排斥实验、MTS法、Brdu渗入实验检测表达ALR shRNA慢病毒干扰ALR表达对U266增殖的影响。最后，通过流式细胞计数检测U266细胞凋亡情况，Realtime PCR检测凋亡相关因子P53、Bax、Bcl-2、survivin变化情况。结果：1、台盼蓝染色、MTS实验结果显示外源性加入ALR能促进U266细胞的增殖，且具有一定范围内的浓度-效应关系，外源性加入抗ALR单克隆抗体能够抑制U266细胞的增殖。2、成功构建了表达ALR shRNA干扰慢病毒，荧光显微镜显示shRNA干扰慢病毒能顺利感染U266细胞株，其MOI值为1时，感染效率达80%。3、Real-time PCR检测表达ALR shRNA慢病毒感染U266细胞株72h后ALR mRNA水平明显降低，约为对照shRNA慢病毒组的20%左右；Western blot检测表达ALR shRNA慢病毒感染U266细胞株72h后ALR蛋白水平明显降低。4、台盼蓝染色、MTS法、Brdu渗入实验均显示表达ALR shRNA慢病毒感染U266细胞株72h后，细胞增殖明显受抑，其差异具有统计学意义（P<0.05）。5、流式细胞仪检测结果显示表达ALR shRNA慢病毒感染U266细胞株72h后细胞凋亡明显上升，Realtime PCR显示凋亡相关因子Bax明显上调，而Bcl-2明显下调，差异均具有统计学意义（P<0.05）。结论：1、外源性ALR能够促进人多发性骨髓瘤细胞株U266的增殖。2、外源性中和U266细胞自分泌的ALR，能够抑制U266细胞的增殖。3、表达ALR shRNA干扰慢病毒能够内源性沉默ALR的表达。4、内源性沉默ALR的表达能够抑制U266细胞的增殖，并且通过影响凋亡相关因子Bax和Bcl-2来调控U266细胞的凋亡。第三部分：表达ALR shRNA慢病毒感染U266细胞株后多个家族细胞因子变化情况的研究。目的：通过前两部分我们证实了ALR对U266细胞株的促增殖和抗凋亡作用，本部分利用慢病毒转染U266细胞株沉默ALR基因表达后，ELISA法检测与多发性骨髓瘤增殖和凋亡相关的多个家族细胞因子变化，筛选出可能与ALR蛋白表达相关的细胞因子，从而为进一步的机制研究奠定基础。方法：利用ELISA法分别检测表达ALR shRNA慢病毒感染U266细胞株后细胞因子IL-6、IL-10、VEGF、TNF-α的水平。结果：ELISA检测结果显示表达ALR shRNA慢病毒感染U266细胞株后其上清中IL-6水平明显下调，与对照组比较，其差异具有统计学意义（P<0.05）。而IL-10、VEGF、TNF-α的水平与对照组比较无统计学差异（P>0.05）。结论：内源性沉默U266细胞株的ALR表达能够明显下调细胞因子IL-6水平，但对细胞因子IL-10、VEGF、TNF-α无影响。
论文目录
相关论文文献
标签：人多发性骨髓瘤细胞株论文; 小鼠骨髓瘤细胞株论文;