利用转基因技术创造适合纤维素乙醇生产的玉米新材料

论文摘要

由于化石能源的不可再生性和最终枯竭的不可避免性,能源危机已经成为世界性的问题。可再生的清洁的生物质能源已成为人们关注的热点,其中燃料乙醇的研究与生产最引人注目。目前,燃料乙醇主要是用玉米、甘蔗、薯类等农作物发酵生产,成本过高,广泛应用受限。寻找新的生产原料和技术、降低燃料乙醇的生产成本,已成为国内外热点研究课题。玉米作为一种饲料、粮食和能源作物,具有很高的综合利用价值。其作为C4植物具有高光合速率和生长速率、能高效利用水资源、适应区广、生育期较短等特点,是既产粮食又产生大量生物质的生产者。利用玉米淀粉生产燃料乙醇因“与人争粮”而面临尴尬,而利用玉米生物质生产乙醇可充分利用玉米的生长特点,具有广阔的前景。玉米生物质的主要成分是木质纤维素,而利用木质纤维素生产乙醇由于生产成本一直居高不下而阻碍了其规模化生产。利用纤维素酶的催化反应代替高温高压的化学反应将纤维素水解为葡萄糖,再通过发酵可生产乙醇等有机化工原料和燃料等在实践中存在较大困难。主要原因之一是纤维素酶的生产及木质纤维素预处理过程成本非常高。若能降低纤维素水解复合酶的应用成本则使纤维素乙醇的生产成本大幅度降低。通过植物基因工程的方法来生产纤维素酶、半纤维素酶以及通过改变木质素含量或成份来减少预处理过程都是可解决这些问题的途径。本论文工作的主线是利用转基因技术培育能自身表达高活性纤维素酶的转基因玉米植株和培育低木质素的有利于纤维素酶降解茎叶的玉米材料,以获得适宜纤维素乙醇生产的玉米新种质,为降低生物质生产乙醇的成本而探索。（一）在玉米中过表达微生物基因编码的纤维素酶依据已发表资料,从丝状真菌瑞氏木霉中克隆了编码外切葡聚糖酶基因的CBHI和编码内切葡聚糖酶基因的EGⅢ。为了控制转基因表达,克隆出丝状真菌构巢曲霉（Aspergillus nidulans）的乙醇诱导型启动子αlc系统。测序结果表明,后者碱基序列与已报道的序列有所差异,但是转录起始位点、TATA box和与转录因子alcR结合位点中的高度保守序列位置及序列均完全相同。用获得的启动子构建带有GUS融合基因的植物表达载体,利用基因枪法轰击玉米胚芽鞘进行瞬时表达分析,染色结果确定了该启动子具有乙醇诱导表达的功能。将纤维素酶基因和乙醇诱导启动子构建的融合基因插入到植物表达载体中,通过农杆菌介导的玉米芽尖转化法转入玉米,获得了转基因的玉米株系。对转基因玉米植株的后代进行PCR和Southern杂交分析,肯定了外源基因在玉米基因组中稳定整合并遗传给后代,转基因拷贝数为1-2个。分别检测3叶期和10叶期的转基因玉米,了解乙醇诱导启动子在玉米中能否启动诱导表达,以及不同乙醇浓度、诱导时间、持续诱导等因子对乙醇诱导基因表达强度的影响。在玉米植株中,alc系统可以严谨的控制目的基因的表达。在非诱导状态下,alc系统在转基因玉米中处于关闭状态,通过根部浇灌酒精后可启动目的基因的表达。该系统非常灵敏,用0.1%（v/v）酒精诱导就能检测到外源基因的表达。采用MUC的方法测定转基因植株CBHI酶活性,得出酶活性变化与转基因表达强度的变化是一致的。随着浇灌的酒精浓度升高,转基因植株CBHI酶活性增加,在2%（v/v）时达到最高峰,24h时酶活性达到2400 pmol MU min-1 mg TSP-1,之后酶活性不再升高。因此,选用2%的酒精浓度作为最佳浓度进行后续试验。该浓度酒精对玉米植株无可见的毒害作用。不同酒精诱导时间的试验得出,随着诱导时间的延长,1nRNA及酶活性均有升高,最高点在96小时,酶活性达到4000 pmol MU min-1 mg TSP-1。若在第一次诱导72小时后再施用酒精进行诱导,酶活性能进一步提高,达到5000 pmol MU min-1 mg TSP-1,这种水平可一直持续。2%的酒精诱导24小时之后,转基因玉米的不同器官都检测到酶活性,介于1278 pmol MU min-1 mg TSP-1到2026 pmol MU min-1 mg TSP-1,以叶中的酶活性最高。用2%（v/v）的酒精以根部浇灌的方式诱导转EGⅢ基因植株,随着酒精诱导时间的延长,EGⅢ基因表达强度和酶活性逐步升高。无论是在酒精诱导前后,转基因植株和未转基因对照植株的生长发育和形态特征未出现显著差异。转基因玉米植株产生的纤维素酶在不加任何保护剂的情况下分别在不同pH值和不同温度下测定酶活性,并与最高的酶活性相比较,计算其相对活性（%）。外切葡聚糖酶CBHⅠ在pH5.0、温度45-50℃时较为稳定,而内切葡聚糖酶在pH4.5-5.0、温度为50℃时较为稳定。与大肠杆菌中表达的酶相比,具有更高的热稳定性及更宽广的pH值适宜范围。将转基因植株叶片提取液分别在50℃和60℃下保温,两种纤维素酶的活性都随着保温时间延长而下降,变化趋势较为一致。在50℃条件下放置2h,酶活性能够保持在80%左右,而在60℃条件下放置1h时,酶活性就降低到40%以下。因此,转基因玉米表达的纤维素酶可以耐受较长时间的50-60℃高温,具有一定的热稳定性。将转基因玉米叶片在不同温度下保存,然后测定其酶活性。两种酶活性变化趋势类似,在常温（28℃）条件下保存时,1天后酶活性降低到最初的85%左右,3天时降低到63%左右,5天的时为41%左右。若将叶片保存在-20℃,5天后酶活性为最初活性的85%。因此,转基因玉米植株可以在低温储存条件下保持较长时间纤维素酶活性。将两种纤维素酶液混合,用于降解纤维素,用DNS法测定还原糖的生成量。结果表明,两种纤维素酶在降解纤维素方面具有协同作用,两种酶一同降解纤维素的效果要比单酶降解效果好,能够产生更多的还原性糖。并且随着加入的酶蛋白增多,还原性多糖的生成量增加。（二）玉米木质素合成酶基因的抑制表达对木质素含量的影响木质素合成是由多个酶促反应组成的复杂过程,肉桂醇脱氢酶(CAD夕和肉桂酰辅酶A还原酶（CCR）基因编码木质素合成途径中催化最后两步的关键酶。以玉米为材料,从cDNA中克隆出CAD和CCR基因,分别构建它们的RNAi结构。利用载体pFGC5941构建出由组成型启动子CaMV35S启动RNAi结构和以除草剂抗性基因bar为筛选标记的植物表达载体,通过农杆菌介导的玉米芽尖转化方法获得玉米转化植株。经过PCR检测和Southern杂交鉴定,确定了RNAi结构已整合到玉米的基因组中且稳定遗传。采用RT-PCR方法检测靶基因的表达,得出未转基因对照植株和转基因植株均出现扩增产物,转基因植株的扩增产物亮度明显弱于未转基因对照的。采用Real-time RT-PCR检测靶基因的表达强度,得出不同转基因株系的表达丰度有一定差异。在抑制CAD表达的转RNAi结构株系中,CAD基因表达丰度为对照植株的40%～89%。在抑制CCR表达的转RNAi结构株系中,CCR基因表达丰度为对照植株的36%-94%。即RNAi结构的导入,转基因植株的内源CAD和CCR基因的转录本减少。转基因植株的酶活性测定表明,在抑制CAD基因的株系中酶活性是对照植株的65%-93%,在抑制CCR基因的株系中酶活性是对照的59%-90%。在这些转基因株系中CAD和CCR基因的表达变化与酶活性的变化趋势一致,表明是RNAi结构的表达导致这两个基因的表达下降而引起植株CAD或CCR酶活性降低。对转基因植株性状观测发现,转CAD基因株系与野生型对照相比,株高和叶片大小大致相同,抗倒性和抗病性变化不明显,开花和结籽正常。在转CCR基因的株系中,有些株系的植株与野生型大致相同,也有部分株系的植株与野生型相比株高偏低,但开花结籽正常,抗倒性和抗病性无明显变化。说明转基因植物中木质素足以维持植物正常的生理活动。对生长3个月的灌浆期转基因植株进行Klason木质素分析,与对照植株相比,转基因株系的Klason木质素都有不同程度的下降,占细胞壁干重19-20%。RNAi抑制CCR基因表达对木质素含量的影响要强于CAD的抑制作用。在转CAD基因株系中,木质素减少的变化范围为7.5-14.7%；在转CCR基因株系中,木质素减少的变化范围为11.7-18.9%。可见应用RNAi技术能有效抑制靶基因表达,进而降低转基因植株的木质素含量,但降低幅度仍待提高。在转基因植株中,尽管木质素含量下降,但综纤维素含量与对照相比并没有明显差别,说明木质素合成被抑制没有影响综纤维素的合成和积累。在本实验中,无论是干扰CAD还是干扰CCR的表达,在转基因植株中都能检测到PAL转录本丰度明显提高,与之对应的是可溶性总酚含量明显提高。植物体内大多数酚类物质的合成经历苯丙烷类合成途径,PAL是该条途径的关键酶,PAL表达强度的提高和可溶性酚类物质的增加表明细胞碳代谢可能发生重大调整。有可能木质素合成的下游步骤被限速,刺激了植株产生相应的反应,促进中间物向酚类物质合成途径分配,以保证有足量得可溶性糖类物质流入细胞次生代谢。由于酚类物质是植保素的最重要成员,其含量增多意味着植物抗病能力的提高。阿魏酸在细胞壁的积累可能是由于CAD及CCR活性降低的结果,很可能是木质素含量下降而植株抗病性和抗倒性无明显变化的原因。从转基因玉米植株表型来看,木质素适当降低可以维持玉米植株的正常生理活动和生长发育。综上所述,αlc系统在转基因玉米中能够严谨的控制外源基因的表达,这是在单子叶植物中运用化学可诱导系统成功控制外源基因表达的一个成功实例,为玉米基因功能研究提供了一个有用的工具。本工作得到了能在转基因植株中表达异源纤维素酶和降低了木质素含量的玉米骨干自交系工程株系,为进一步利用玉米生物质进行燃料乙醇的生产提高了重要资料和植物材料。

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中文摘要

Abstract

符号说明

第一章前言

1.1 生物质能源的兴起

1.1.1 能源危机

1.1.2 生物乙醇发展概况

1.1.3 粮食淀粉和糖类作物制取燃料乙醇

1.1.4 木质纤维素制取燃料乙醇

1.1.4.1 木质纤维素

1.1.4.2 制约木质纤维素制取燃料乙醇的关键问题

1.2 利用转基因技术促进木质纤维素有效利用

1.2.1 纤维素降解与纤维素酶生产

1.2.1.1 纤维素降解与纤维素酶

1.2.1.2 纤维素酶的异源表达

1.2.1.2.1 在细菌中表达纤维素酶

1.2.1.2.2 酵母表达系统

1.2.1.2.3 丝状真菌中表达纤维素酶

1.2.1.2.4 转基因植物

1.2.2 木质素生物合成及其遗传改良

1.2.2.1 木质素组成与分布

1.2.2.2 木质素生物合成途径

1.2.2.3 木质素合成的遗传改良

1.3 异源纤维素酶基因表达和木质素含量降低对转基因植物的影响

1.3.1 异源纤维素酶基因表达对转基因植物的影响

1.3.2 降低木质素含量对转基因植物的影响

1.3.2.1 木质素总量合成的生物调控

1.3.2.2 木质素单体特异合成相关酶的合成调控

1.4 本工作的目的和意义

第二章乙醇诱导启动子的克隆

2.1 材料

2.1.1 菌株和质粒载体

2.1.2 药品及试剂

2.2 方法

2.2.1 构巢曲霉基因组DNA的提取

2.2.2 alcA启动子的克隆

2.2.2.1 引物设计和PCR反应

2.2.2.2 PCR产物的回收,克隆和测序

2.2.3 构巢曲霉总RNA的提取及cDNA合成

2.2.3.1 总RNA的提取

2.2.3.2 mRNA的分离

2.2.3.3 cDNA合成

2.2.4 转录因子alcR的克隆

2.2.5 含有乙醇诱导启动子的植物表达载体的构建

2.2.5.1 质粒DNA的制备和纯化

2.2.5.2 质粒DNA的限制性酶切

2.2.5.3 DNA片段的去磷酸化

2.2.5.4 DNA片段的回收和定量

2.2.5.5 DNA片段的补平加A反应

2.2.5.6 目的DNA片段与载体DNA的连接

2.2.5.7 大肠杆菌感受态的制备和转化

2.2.5.8 重组质粒的鉴定

2.2.5.9 重组质粒转入农杆菌

2.2.6 报告基因的瞬时表达分析

2.2.6.1 实验材料

2.2.6.2 培养基和试剂

2.2.6.3 利用基因枪转化玉米胚芽鞘

2.2.6.4 GUS组织化学检测

2.3 结果与分析

2.3.1 构巢曲霉DNA的提取和alcA片段的克隆

2.3.2 构巢曲霉RNA的提取及转录因子alcR的克隆

2.3.3 含有乙醇诱导启动子的植物表达载体的构建与鉴定

2.3.4 基因枪轰击玉米胚芽鞘

2.4 讨论

第三章真菌纤维素酶基因CBHⅠ和EGⅢ在转基因玉米中表达

3.1 材料与方法

3.1.1 材料

3.1.1.1 植物材料

3.1.1.2 菌株和质粒

3.1.1.3 药品和试剂

3.1.2 方法

3.1.2.1 瑞士木霉总RNA的提取及cDNA合成

3.1.2.1.1 Trizol试剂提取瑞士木霉总RNA

3.1.2.1.2 反转录

3.1.2.2 纤维素酶基因的克隆

3.1.2.3 PCR去除纤维素酶基因的信号肽

3.1.2.4 植物表达载体的构建

3.1.2.5 农杆菌介导的玉米芽尖的遗传转化

3.1.2.5.1 用于玉米转化的培养基

3.1.2.5.2 重组质粒转入农杆菌

3.1.2.5.3 玉米转化受体的准备

3.1.2.5.4 农杆菌培养和玉米无菌苗转化

3.1.2.5.5 转化植株的筛选与定植

3.1.2.6 转基因玉米植株后代的遗传学分析

3.1.2.7 转基因玉米的分子生物学检测

3.1.2.7.1 PCR检测

3.1.2.7.2 Southern杂交检测

3.1.2.7.3 Real-time RT-PCR检测

3.1.2.8 酒精诱导条件

3.1.2.9 纤维素酶活性测定

3.1.2.10 转基因玉:米植株中纤维素酶酶学特性的分析

3.1.2.11 纤维素含量测定

3.1.2.12 纤维素酶解实验

3.1.2.13 试验设计与数据处理

3.2 结果与分析

3.2.1 纤维素酶基因的克隆

3.2.2 植物表达载体的构建与鉴定

3.2.3 转基因玉米的获得

3.2.4 转CBHⅠ基因玉米植株乙醇诱导活性的初步鉴定

3.2.5 不同酒精诱导浓度对alc系统诱导活性的影响

3.2.6 不同酒精诱导时间对alc系统诱导活性的影响

3.2.7 持续酒精诱导的影响

3.2.8 转CBHⅠ基因玉米不同组织部位的表达情况

3.2.9 转EGⅢ基因的玉米植株中基因表达情况检测

3.2.10 pH值和温度对转基因玉米中酶活性的影响

3.2.11 不同温度储存对转基因植株叶片酶活性的影响

3.2.12 纤维素含量的测定

3.2.13 纤维素酶解试验

3.2.14 转基因玉米植株的生长发育

3.3 讨论

第四章利用RNAi技术抑制玉米木质素合成基因CAD和CCR基因的表达

4.1 材料与方法

4.1.1 材料

4.1.1.1 植物材料

4.1.1.2 菌株和质粒

4.1.1.3 试剂和药品

4.1.2 实验方法

4.1.2.1 玉米总RNA的提取及cDNA的合成

4.1.2.2 玉米肉桂醇脱氢酶基因（CAD）和肉桂酰辅酶A还原酶基因（CCR）的克隆

4.1.2.3 RNAi结构表达载体的构建

4.1.2.4 农杆菌介导的玉米芽尖的遗传转化和分子检测

4.1.2.5 酶活测定方法

4.1.2.6 木质素含量的测定

4.1.2.7 综纤维素含量的测定

4.1.2.8 可溶性总酚含量的测定

4.1.2.9 可溶性总糖测定

4.1.2.10 试验设计与数据处理

4.2 结果与分析

4.2.1 玉米CAD基因和CCR基因的克隆

4.2.2 RNAi结构的构建与鉴定

4.2.3 转RNAi结构玉米的分子检测

4.2.4 转RNAi结构玉米植株的遗传学分析

4.2.5 目标基因表达强度的检测

4.2.6 转RNAi结构玉米植株酶活性测定

4.2.7 木质素含量测定

4.2.8 综纤维素含量测定

4.2.9 可溶性总酚含量测定

4.2.10 可溶性糖含量测定

4.2.11 玉米木质素合成相关基因在转基因玉米中的表达分析

4.2.12 转RNAi结构玉米植株的生长发育

4.3 讨论

第五章总结与展望

5.1 过表达微生物来源纤维素酶基因玉米的利用价值

5.2 利用RNAi技术干扰玉米木质素合成

5.3 本工作的创新点

5.4 展望

参考文献

致谢

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