论文摘要
免疫治疗已经成为肿瘤治疗的重要手段。围绕细胞因子开展的基因治疗是肿瘤免疫治疗研究的重要组成部分。肿瘤基因治疗面临的重要挑战之一是实现目的基因的肿瘤靶向性。在肿瘤增大的过程中需要构建血管,因此,内皮系细胞可能具有肿瘤靶向性。有研究显示间充质干细胞（MSCs）可以分化成内皮系细胞。本研究探讨了MSCs诱导分化为内皮系细胞,并作为人伽玛干扰素（hγIFN）基因的载体用于肿瘤治疗的可行性。用梯度离心法从健康骨髓捐献者的骨髓分离出单个核细胞,在体外传代培养其中的贴壁细胞,用流式细胞仪检测第3代细胞的表面标志,发现该细胞CD29、CD44、CD166阳性,CD14、CD45、CD34、CD31、CD106、CD133、VEGFR-2、HLA-DR阴性,与文献报道的MSCs标志相一致。参照文献报道的方案,用血管内皮生长因子（VEGF165,20 ng/ml）在体外诱导MSCs,2周后检测细胞标志,发现CD34、CD133和VEGFR-2转化为阳性,说明该细胞分化为内皮祖细胞（EPCs）。在体外培养发现,EPCs也具备一定的增殖能力。用增强型绿色荧光蛋白（EGFP）基因作为报告基因,当携带EGFP基因的腺病毒（Ad5-EGFP）对EPCs的感染复数（ MOI ）为150 pfu/EPC时,感染2天后用流式细胞仪检测,EGFP阳性的EPCs可达95%以上。说明腺病毒对EPCs的感染效率较高。EPCs-EGFP体外培养发现,腺病毒载体感染对EPCs的增殖活性影响不大。携带人伽玛干扰素（hγIFN）基因的腺病毒（Ad5-hγIFN）感染EPCs后,用ELISA方法检测EPCs-hγIFN的培养液中hγIFN浓度,转染第2天hγIFN浓度即可达1300 pg/ml以上,从第6天到第14天均在1400 pg/ml以上。说明该基因载体的表达活性较高而且表达稳定性好。在3种肿瘤（Lovo结肠癌细胞、SGC7901胃癌细胞和H460肺癌细胞细胞）中分别加入不同浓度的hβIFN和hγIFN。培养4天后,用MTT实验观察细胞的活性,发现hβIFN和hγIFN对肿瘤细胞的抑制呈现浓度依赖。高浓度的hβIFN或者hγIFN（≥100 IU/ml或者200 IU/ml）对肿瘤细胞产生抑制作用。用荧光染料CFSE标记3种肿瘤细胞,分别与EPCs-hβIFN按5:1的浓度混合培养4天。流式细胞仪检测肿瘤细胞,结果与空白对照组比较,EPCs-hβIFN对3种肿瘤细胞有明显的抑制作用（P<0.05）,作用后的肿瘤细胞存活率:Lovo结肠癌细胞为82.34%±6.12%;SGC7901胃癌细胞为77.89%±3.99%;H460肺癌细胞为76.98%±6.19%。EPCs-hγIFN对3种肿瘤细胞也产生明显的抑制作用（P<0.05）,与对照组比较,肿瘤细胞存活率:Lovo结肠癌细胞为69.52%±3.78%;SGC7901胃癌细胞为79.36%±6.35%;H460肺癌细胞为77.87%±6.50%。而EPCs对3种肿瘤细胞的生长未产生影响。用Lovo结肠癌细胞制作裸鼠皮下肿瘤模型（n = 8）,尾静脉注射（ IV ） EPCs-EGFP。分别在5天和10天后,取肿瘤和主要脏器切片,HE染色,在荧光显微镜下观察EPCs-EGFP在肿瘤和主要脏器的分布。发现荧光细胞集中到肿瘤的周边部,形成包裹样分布,在其它组织器官没有荧光细胞分布,说明EPCs具有肿瘤的靶向性。为了观察EPCs-hγIFN在体内对肿瘤的抑制作用,我们将荷瘤裸鼠分为4个组。第1组为对照组,PBS 100μl IV,每周1次（n = 7）;第2组EPCs-hγIFN 1×106 IV,每周1次（n = 8）;第3组皮下注射（ SC ）10,000 IU hγIFN,每周3次（n = 5）;第4组EPCs-EGFP 1×106 IV,每周1次（n = 5）。治疗4周后,第2组肿瘤重量（ 0.48±0.78 g ）与第1组肿瘤重量（2.47±2.58 g）比较,差别具有统计学意义（P<0.05）。其它两组肿瘤重量与第1组没有差异。本研究还研究了EPCs-hγIFN对荷瘤裸鼠生存的影响。7只荷瘤裸鼠分别EPCs-hγIFN 1×106 IV,每周1次;对照组（n = 7）PBS 100μl IV,每周1次,共治疗4周。从治疗开始到裸鼠死亡记录为生存期,EPCs-hγIFN组荷瘤鼠的中位生存期为35天（95%的可信区间为33.83～36.17天）,与对照组的中位生存期32天（95%的可信区间为26.87～37.13天）相比,差别具有统计学意义（P<0.05）。用ELISA法检测EPCs-hγIFN 1×106 IV（n = 3）和hγIFN 10,000 IU SC（n = 3）的血浆hγIFN,发现在EPCs-hγIFN注射1天后,血浆hγIFN浓度为486.36±52.12 pg/ml,3天后为185.77±22.59 pg/ml。而hγIFN组在注射1小时后,血浆hγIFN浓度达1116.38±87.19 pg/ml,但1天后仅为21.04±5.15 pg/ml,2天后不能测得。EPCs-hγIFN IV血浆hγIFN峰浓度不及hγIFN SC,但是疗效好,说明了肿瘤局部稳态高hγIFN浓度的重要意义。很多晚期肿瘤患者,尤其是年老体弱患者,肿瘤治疗的目标已经不是完全治愈,而提高生活质量,延长生存更为重要。对于这部分病人,如果通过化疗使病情得到控制后,换用副作用轻微的治疗手段来维持治疗显得更有意义。本研究尝试在CPT-11化疗后给予EPCs-hγIFN维持治疗,并与C225 （Cetuximab）或EPCs-hγIFN + C225作为维持进行了比较。在体外研究中,第1组为单独培养的Lovo细胞,作为空白对照;第2组加入CPT-11 1μM,第1天;第3组,CPT-1 1μM,第1天+ hγIFN 500 IU/ml,第2～4天;第4组,CPT-11 1μM,第1天+ C225 20μg/ml,第2～4天;第5组,CPT-11 1μM,第1天+ C225 20μg/ml + hγIFN 500 IU/ml,第2～4天。MTT检测细胞活性。与空白对照组相比,各组Lovo细胞的细胞活性为:第2组,92.77%±2.72%;第3组,82.44%±4.57%;第4组,85.16%±2.96%;第5组,80.68%±9.14%。其它组细胞活性与第1组相比,细胞活性降低（P<0.05）。第2组与第3、第4、第5组相比,细胞活性也存在统计学差别（P<0.05）。第3、第4和第5组之间细胞活性的差别没有统计学意义。在体内实验中,第1组为空白对照组,PBS 100μl IV,每周1次（n = 9）。各实验组在统一给予腹腔注射（IP）CPT-11（50mg,2次）治疗1周后,分别给予PBS 100μl IV,每周1次（第2组,n = 9）;EPCs-hγIFN 1×106 IV,每周1次（第3组,n = 10）; C225 0.5 mg IP,每周2次（第4组,n = 10）;EPCs-hγIFN 1×106 IV,每周1次+ C225 0.5 mg IP,每周2次（第5组,n = 10）。在治疗4周后,各组肿瘤的平均体积:第1组为2024.28±1048.40 mm3;第2组为764.94±720.14 mm3;第3组为233.85±186.97 mm3;第4组为186.95±133.43 mm3;第5组为163.9±173.39 mm3。其它组肿瘤体积与第1组相比差别有统计学意义（P<0.05）;第2组肿瘤体积与第3、第4和第5组相比,差别有统计学意义（P<0.05）。第3、第4和第5组之间肿瘤体积的差别没有统计学意义（P>0.05）。记录每只荷瘤裸鼠从治疗开始到死亡的天数为生存时间。第1组平均生存期为:34.2天,95%可信区间为32.8～35.6天;第2组:39.4天,95%可信区间为37.1～41.8天;第3组:44.5天,95%可信区间为42.9～46.1天;第4组:48.5天,95%可信区间为46.5～50.4天;第5组:51.3天,95%可信区间为49.8～52.8天。Kaplan-meier分析显示,其它组生存期均比第1组延长（P<0.01）。第3、第4和第5组生存期较第2组延长（P<0.01）。第4组和第5组的生存期较第3组延长（P<0.01）。第4组和第5组生存期的差别没有统计学意义（P>0.05）。以上的研究结果证明,MSCs在体外可以诱导为EPCs。EPCs免疫原性低,经静脉注射可以靶向分布到肿瘤周边,可以作为hγIFN的基因载体,抑制肿瘤生长。说明EPCs可以作为基因的载体靶向作用于肿瘤微环境,进行肿瘤微环境的免疫调节和抗肿瘤的研究。在化疗起效后给予EPCs-hγIFN作为维持治疗,可以抑制肿瘤的生长,延长荷瘤裸鼠的生存。与分子靶向药物C225联合可以进一步提高疗效。EPCs携带免疫性基因是进行肿瘤维持治疗研究的良好选择。