论文摘要
骨髓增生异常综合征（myelodysplastic syndrome,MDS）是一组以不同程度的外周血细胞减少伴随骨髓无效造血为特征的恶性克隆性疾病。目前仍被认为是不可治愈的。1997年世界卫生组织制定了MDS国际预后评估系统（IPSS）,根据骨髓中原始细胞比例,染色体核型和外周血三系减少程度将MDS分为低危组（0分）,中危组（0.5—2.0分）和高危组（2.5分以上）。中危和高危MDS患者虽然骨髓肿瘤细胞过度增殖,但是往往合并外周血三系减少,骨髓代偿能力差,治疗非常棘手。多数患者必须依靠输血才能维持生存,并最终转化为急性髓系白血病（acute myeloid leukemia,AWL）后死亡,预后极差。大部分MDS患者年龄超过70岁,无法接受强烈的化疗和骨髓移植治疗。虽然胞苷衍生物5—氮杂胞苷（5—aza—cytidine,Aza C）和5—氮杂—2‘一脱氧胞苷（5—aza-2’-deoxycitidine,Decitabine,DAC）已被美国FDA批准用于MDS的治疗,但是明显的骨髓抑制的副作用限制了其临床应用。因此寻找效果好且骨髓抑制轻的新的治疗方法以改善中危和高危MDS患者的预后,仍是目前MDS治疗研究的焦点。尿多酸肽（Uroacitides）,又名CDA-Ⅱ（cell differentiation agentⅡ）是从健康人尿中经酸化、吸附、洗脱、真空干燥等过程制成的含有多种有机酸和多肽成分的非细胞毒性药物。CDA-Ⅱ的这些成分共同作用来发挥其抗肿瘤作用。前期研究表明,CDA-Ⅱ具有诱导肿瘤细胞分化的作用,在实体瘤的治疗中显示出一定的疗效。我们设想,CDA-Ⅱ可以与三氧化二砷一样,既具有促分化作用又具有诱导凋亡作用。如果这一假设成立,那么它的作用靶点与作用机理呢?此外,由于CDA-Ⅱ是从健康人尿中提取的有效成分,其毒副作用一般不会太大,比较适合老年病人,而MDS多见于老年患者。基于上述考虑,我们选择MDS-RAEB细胞株MUTZ-1进行体外及动物实验研究以观察CDA-Ⅱ对中危及高危MDS的作用及作用机制,以期为临床MDS治疗提供新的方法和思路。本研究分三部分进行:第一部分:尿多酸肽（CDA-Ⅱ）通过影响细胞生存信号通路诱导骨髓增生异常综合征细胞凋亡第二部分:尿多酸肽（CDA-Ⅱ）对骨髓增生异常综合征细胞PTEN和p15INK4B基因异常甲基化模式的影响第三部分:尿多酸肽（CDA-Ⅱ）对骨髓增生异常综合征细胞端粒酶活性及人端粒酶逆转录酶（hTERT）表达的影响及机制第一部分:尿多酸肽（CDA-Ⅱ）通过影响细胞生存信号通路诱导骨髓增生异常综合征细胞凋亡目的:探讨CDA-Ⅱ对MDS细胞的作用和作用机制以及对MDS细胞PI3K/Akt及NF-κB生存信号途径的影响,同时研究CDA-Ⅱ对人MDS荷瘤小鼠瘤体生长的抑制作用,以期从细胞水平和实验动物水平明确CDA-Ⅱ对MDS的作用及作用机制,为高危MDS的靶向治疗提供实验基础。方法:采用MTT比色法研究CDA-Ⅱ对MDS,白血病和淋巴瘤细胞株以及MDS原代细胞和正常人骨髓单个核细胞的体外生长抑制作用:采用Wright-Giemsa染色、流式细胞仪PI染色检测亚G1峰和Annexin V/PI双染色检测细胞凋亡;采用流式细胞仪PI染色检测细胞周期、JC-1染色检测细胞线粒体膜电位的改变:用Western-blot方法检测CDA-Ⅱ作用后MUTZ-1细胞Caspase家族蛋白,细胞周期蛋白,凋亡相关蛋白Bcl-2家族,凋亡抑制蛋白IAPs家族和FLIP蛋白的表达,并进一步加用Caspase-3抑制剂Z-DEVD-FMK来观察实验结果;提取核浆蛋白以观察CDA-Ⅱ作用对NF-κB信号通路的影响,并进一步加用TNF-α来证实CDA-Ⅱ对NF-κB核转位的影响;Western-blot方法检测CDA-Ⅱ对MUTZ-1细胞PI3K/Akt和NF-κB信号通路相关生存蛋白的影响,并进一步加用PI3K抑制剂LY294002和NF-κB抑制剂PDTC来明确两条信号通路的相关性及机制:用RT-PCR方法检测CDA-Ⅱ对表达PI3Kp110α蛋白的PIK3CA基因的影响,以明确CDA-Ⅱ治疗的靶点:用人MDS荷瘤小鼠模型观察CDA-Ⅱ对小鼠瘤体生长和平均生存期的影响以及比较用药前后瘤组织细胞形态和p-Akt的原位表达,从而明确CDA-Ⅱ在实验动物水平对MDS细胞的生长抑制作用,并评估实验治疗剂量的安全性。结果:①CDA-Ⅱ体外可以抑制MDS,白血病和淋巴瘤细胞株生长,其中髓系白血病细胞株较淋系血液肿瘤细胞株更敏感,最敏感的为MUTZ-1细胞株:CDA-Ⅱ体外可以抑制MDS细胞株MUTZ-1及MDS原代细胞的生长,并呈浓度和时间依赖性,但不影响正常人骨髓单个核细胞的生长。②CDA-Ⅱ体外可以诱导MUTZ-1细胞株和MDS原代细胞凋亡,并呈浓度依赖性。③CDA-Ⅱ在体外可以诱导MUTZ-1细胞株出现G1期细胞周期阻滞,并下调细胞周期相关蛋白Cyclin D1和CDK4表达,呈剂量依赖性。④不同浓度CDA-Ⅱ作用可以激活Caspase-9,3,呈浓度依赖性,并伴有明显的线粒体膜电位下降:当CDA-Ⅱ浓度超过4mg/mL时激活Caspase-8,呈浓度依赖性:Caspase-3抑制剂可以抑制CDA-Ⅱ诱导的MUTZ-1细胞凋亡。⑤不同浓度CDA-Ⅱ作用可以下调Bcl-2家族抗凋亡蛋白Bcl-2,Mcl-1,p-Bad和上调促凋亡蛋白Bax的表达,呈浓度依赖性;CDA-Ⅱ在浓度超过4mg/mL时可以激活Bid,并呈浓度依赖性。⑥CDA-Ⅱ可以抑制MUTZ-1细胞IAPs家族中的CIAP1,XIAP和Survivin的表达,呈浓度依赖性,但不影响CLAP2的表达。⑦MUTZ-1细胞高表达FLIPL:且CDA-Ⅱ在浓度超过4mg/mL时,可以明显抑制FLIPL表达,呈浓度依赖性。⑧不同浓度CDA-Ⅱ作用可以抑制IκBα磷酸化和NF-κB核转位,也可以抑制TNF-α诱导的IκBα磷酸化和NF-κB核转位;CDA-Ⅱ与NF-κB抑制剂PDTC联用可以明显下调NF-κB信号通路下游信号分子IAPs家族,FLIPL,Bcl-2,Cyclin D1的表达。⑨不同浓度和不同时间CDA-Ⅱ作用可以下调PIK3CA mRNA表达:PI3K抑制剂LY294002与CDA-Ⅱ联用可以明显抑制PI3K/Akt信号通路,并进一步影响其下游的信号蛋白,包括NF-κB信号通路及其下游的信号分子,p-Bad,Bax,Mcl-1和Caspase-9而诱导MUTZ-1细胞凋亡。⑩CDA-Ⅱ可以明显抑制人MDS荷瘤小鼠瘤体生长并延长小鼠平均生存期:CDA-Ⅱ的实验治疗剂量对小鼠体重无明显影响,且未发现有不明原因死亡的小鼠;HE染色和免疫组化检测显示CDA-Ⅱ在实验治疗剂量下可以明显抑制人MDS荷瘤小鼠瘤组织细胞的生长和p-Akt的原位表达。小结:①CDA-Ⅱ体外可以抑制MDS,白血病和淋巴瘤细胞株生长,其中髓系白血病细胞株较淋系血液肿瘤细胞株更敏感,最敏感的为MUTZ-1细胞株:CDA-Ⅱ体外可以抑制MDS原代细胞的生长,但不影响正常人骨髓单个核细胞的生长,对正常骨髓无抑制作用。②CDA-Ⅱ体外可以诱导MUTZ-1细胞株和MDS原代细胞凋亡,并伴有G1期细胞周期阻滞,和细胞周期相关蛋白Cyclin D1和CDK4表达抑制。③CDA-Ⅱ通过启动内源性和外源性细胞凋亡途径诱导Caspase-3依赖型细胞凋亡,并以内源性（线粒体）途径为主,伴有明显的线粒体膜电位下降。④CDA-Ⅱ通过影响Bcl-2家族蛋白Bel-2,Mel-1,p-Bad,Bax和Bid的表达以及抑制IAPs家族中CIAP1,XIAP和Survivin的表达导致线粒体损伤和Caspase-9,3激活诱导细胞凋亡。⑤MUTZ-1细胞高表达FLIPL;且CDA-Ⅱ在浓度超过4mg/mL时,可以明显抑制FLIPL表达,从而解除对Caspase-8的抑制作用诱导凋亡。⑥CDA-Ⅱ可以通过抑制IκBα磷酸化,从而抑制NF-κB核转位来下调MUTZ-1细胞内源性及TNF-α诱导的NF-κB信号通路的活性;再通过作用于NF-κB信号通路下游的信号分子,包括IAPs家族,FLIPL,Bcl-2,Cycl in D1导致MUTZ-1细胞凋亡和细胞周期阻滞:CDA-Ⅱ对MUTZ-1细胞NF-κB信号通路的影响主要通过对PI3K/Akt信号通路的调控来实现。⑦CDA-Ⅱ主要通过影响PIK3CA基因的表达而抑制PI3K/Akt信号通路,并进一步通过影响其下游的信号蛋白,包括NF-κB信号通路及其下游的信号分子,p-Bad,Bax,Mcl-1和Caspase-9而诱导MUTZ-1细胞凋亡。PIK3CA基因为CDA-Ⅱ作用的靶点。⑧CDA-Ⅱ在动物实验中可以明显抑制人MDS荷瘤小鼠瘤体生长并延长小鼠平均生存期;CDA-Ⅱ的实验治疗剂量对小鼠无明显毒副作用;CDA-Ⅱ在实验治疗剂量下可以明显抑制人MDS荷瘤小鼠瘤组织细胞的生长和p-Akt的原位表达。第二部分:尿多酸肽（CDA-Ⅱ）对骨髓增生异常综合征细胞PTEN和p15INK4B基因异常甲基化模式的影响目的:检测抑癌基因PTEN在MDS和MDS转化的AML中的表达和甲基化状态,从而明确PTEN基因与MDS发病和MDS转化为AML的相关性:探讨CDA-Ⅱ对MDS细胞中异常高表达的甲基转移酶DNMT1、3A和3B的作用以及对抑癌基因PTEN和p15INK4B的作用,并以去甲基化药物Decitabine作为阳性对照,为MDS的靶向治疗提供新的方法。方法:用Western-blot方法检测MUTZ-1细胞株、低危MDS、高危MDS、MDS转化的AML患者和正常人骨髓单个核细胞中甲基转移酶DNMT1、3A和3B以及抑癌基因PTEN和p15INK4B蛋白表达情况:用Western-blot方法检测CDA-Ⅱ作用对MUTZ-1细胞甲基转移酶DNMT1、3A和3B以及抑癌基因PTEN和p15INK4B蛋白表达的影响:用RT-PCR方法检测CDA-Ⅱ作用对MUTZ-1细胞甲基转移酶DNMT1、3A和3B以及抑癌基因PTEN和p151NK4B mRNA表达的影响,并以去甲基化药物Decitabine作为阳性对照:用甲基化PCR（MSP）方法检测MUTZ-1和AML细胞株、低危MDS、高危MDS、MDS转化的AML患者以及正常人骨髓单个核细胞中PTEN和p15INK4B的甲基化状态:用MSP方法检测CDA-Ⅱ作用对MUTZ-1细胞PTEN和p15INK4B甲基化状态的影响,同时与去甲基化药物Decitabine作对照,以评价CDA-Ⅱ的有效性。结果:①MUTZ-1细胞株、高危WDS和MDS转化的AML患者高表达甲基转移酶DNMT1、3A和3B,并以DNMT3B为明显;低危组MDS和正常人弱表达DNMT1、3A和3B蛋白。②CDA-Ⅱ可以明显下调MUTZ-1细胞甲基转移酶DNMT1、3A和3B表达,呈时间和剂量依赖性,以对DNMT1的作用最明显。③发现了抑癌基因PTEN在MUTZ-1细胞株、高危MDS和MDS转化的AML患者细胞中均表达缺失,而在低危MDS和正常人细胞中均有表达。④用MSP方法检测并发现了MUTZ-1细胞株和高危MDS以及MDS转化的AML患者PTEN基因完全甲基化:AML细胞株Kasumi-1PTEN基因部分甲基化:AML细胞株KG1,CML细胞株K562,低危组MDS及正常人PTEN基因完全非甲基化,提示PTEN基因在高危MDS和MDS转化的AML中存在高度甲基化,很可能是MDS向AML转变的一个重要的发病机制,可以作为CDA-Ⅱ去甲基化治疗的靶基因。国内外均未见报道。⑤发现了CDA-Ⅱ可以通过去甲基化作用使PTEN启动子区CpG岛甲基化水平降低,导致PTEN mRNA水平和蛋白表达水平均上调,从而发挥对PI3K/Akt信号通路的抑制作用进而诱导MUTZ-1细胞凋亡。国内外均未见报道。⑥发现了CDA-Ⅱ可以通过去甲基化作用使p15INK4B甲基化水平降低,导致p15INK4B mRNA水平和蛋白表达水平均上调,从而发挥对CDK4的抑制作用进而造成MUTZ-1细胞G1期阻滞。小结:PTEN基因在高危MDS和MDS转化的AML中存在高度甲基化,很可能是MDS向AML转变的一个重要的发病机制,靶向PTEN基因的去甲基化治疗可以作为高危MDS和MDS转化的AML患者的治疗策略:CDA-Ⅱ可以通过抑制甲基转移酶DNMT1、3A和3B导致抑癌基因PTEN和p15INK4B因去甲基化而被激活,激活的PTEN可以进一步加强CDA-Ⅱ对PI3K/Akt信号通路的抑制作用而诱导细胞凋亡;p15INK4B可以调控CDA-Ⅱ对CDK4的抑制作用而诱导细胞G1期阻滞。第三部分:尿多酸肽（CDA-Ⅱ）对骨髓增生异常综合征细胞端粒酶活性及人端粒酶逆转录酶（hTERT）表达的影响及机制目的:研究CDA-Ⅱ对MDS细胞端粒酶活性以及人端粒酶逆转录酶（hTERT）表达的影响,并探讨WT1基因和PI3K/Akt/NF-κB信号通路在CDA-Ⅱ影响MUTZ-1细胞hTERT表达中的作用,以期为临床上MDS的靶向治疗提供一个新思路。方法:用TRAP法检测不同浓度和不同时间CDA-Ⅱ作用对MUTZ-1细胞端粒酶活性的影响:用荧光实时定量RT-PCR方法和Western-blot方法分别检测CDA-Ⅱ作用对MUTZ-1细胞hTERT mRNA和蛋白表达的影响:用RT-PCR方法检测CDA-Ⅱ作用对MUTZ-1细胞WT1基因表达的影响:用Western-blot方法检测CDA-Ⅱ与PI3K抑制剂LY294002和NF-κB抑制剂PDTC联用对MUTZ-1细胞hTERT蛋白表达的影响,以明确在CDA-Ⅱ诱导MUTZ-1细胞凋亡过程中PI3K/Akt/NF-κB信号通路对hTERT表达的调控作用。结果:①阐明了CDA-Ⅱ对MDS细胞端粒酶和人端粒酶逆转录酶（hTERT）具有抑制作用,具有首创性。②阐明了CDA-Ⅱ可以通过抑制MUTZ-1细胞端粒酶活性来诱导细胞凋亡,并呈时间和剂量依赖性,这很可能是CDA-Ⅱ诱导MUTZ-1细胞凋亡的Caspase-3非依赖途径。③阐明了CDA-Ⅱ可以抑制MUTZ-1细胞hTERT mRNA和蛋白表达,并呈浓度和时间依赖性,这种抑制作用与CDA-Ⅱ对端粒酶的作用相一致,并与凋亡相关。因此,hTERT是CDA-Ⅱ治疗MDS的新的靶点。④CDA-Ⅱ可以下调MUTZ-1细胞WT1基因的表达,并呈浓度和时间依赖性,由于WT1基因是hTERT启动子的调控基因,因此我们的结果提示CDA-Ⅱ可以通过下调WT1基因表达来抑制hTERT表达从而抑制端粒酶活性。⑤CDA-Ⅱ主要通过抑制PI3K/Akt/NF-κB信号通路来抑制MUTZ-1细胞hTERT蛋白表达,而导致细胞端粒酶活性丧失并诱导凋亡。小结:首次阐明了CDA-Ⅱ对肿瘤细胞端粒酶和人端粒酶逆转录酶（hTERT）具有抑制作用,为CDA-Ⅱ的临床应用提供了一个新的靶点,国内外均未见报道,具有首创性;CDA-Ⅱ可以通过抑制PI3K/Akt/NF-κB信号通路和WT1基因的表达来下调MUTZ-1细胞hTERT基因表达,进而抑制细胞端粒酶活性,并诱导Caspase-3非依赖型细胞凋亡。结论:CDA-Ⅱ在细胞水平和动物水平均能抑制MDS细胞生长,其机理主要为诱导细胞凋亡;CDA-Ⅱ对正常人骨髓没有抑制作用,对实验动物也无明显毒副作用:CDA-Ⅱ是一个多靶向性药物,通过多种成分的共同作用来诱导MDS细胞凋亡,主要通过直接影响PI3K/Akt/NF-κB生存信号通路、通过去申基化作用激活抑癌基因PTEN和p15INK4B以及通过影响hTERT的表达来抑制细胞端粒酶活性三种机制发挥作用（见图3-4）。本研究为MDS治疗药物的选择及探讨药物作用机制提供了体外细胞水平和体内动物水平的实验基础,为临床上MDS的靶向治疗提供了新的思路和方法。
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