论文摘要
苹果酸-乳酸发酵（Malolactic fermentation，MLF）可使新（生）葡萄酒的生青、酸涩等特点消失，达到理想的酸度平衡，微生物稳定性增强。而能够适应葡萄酒环境、较专一地进行MLF、并对葡萄酒质有增益作用的主要是葡萄酒乳酸菌中的酒酒球菌（Oenococcus oeni）。由于葡萄酒生境恶劣复杂，人工接种诱导MLF时，往往由于菌体的大量死亡，而无法成功启动MLF。究其原因有两方面，一是实验室培养获得的菌体失去了对葡萄酒环境的天然抗性，造成接种存活率下降；二是菌体在冷冻干燥过程中受到损伤，导致冻干后存活细菌数量减少。因此，对于直投式葡萄酒乳酸菌发酵剂生产说，除保证菌体的高密度培养外，更需注重培养条件对菌体接种存活率和冻干存活率影响的研究。酒酒球菌SD-2a是本实验室从山东烟台地区自然MLF葡萄酒中分离得到，并获得国家专利保护的优良菌株。深入研究酒酒球菌SD-2a的胁迫适应性反应机制，对开发具有我国自主产权的直投式葡萄酒乳酸菌发酵制剂，具有重要的理论和实践意义。本文以酒酒球菌SD-2a为受试菌材，研究不同培养基组成、酸胁迫处理和乙醇胁迫处理对菌体生长、接种存活率、MLF活性及冻干存活率的影响，以评价在培养过程中，诱导菌体发生酸、乙醇胁迫适应性反应对提高菌体存活率的有效性，为直投式酒酒球菌SD-2a发酵剂的制备提供新的研究思路和基础实验数据。此外，本文通过测定上述培养条件对菌体细胞内MLE活性、H+-ATP酶活性和细胞膜脂肪酸组分的影响，以期初步探讨酒酒球菌SD-2a的酸、乙醇胁迫适应性反应机制。本文得出的主要结果有：（1）与FMATB和MATB培养基相比，ATB培养基培养获得的菌体，其细胞产量分别增加了8．5％和46．2％；其接种模拟酒培养液后的存活率分别提高了20．3％和40．2％；其冷冻干燥存活率分别提高了48．5％和68．3％；不同培养基条件下，菌体生理状态测定结果表明，与FMATB和MATB培养基相比，ATB培养基培养获得的菌体，其H+-ATP酶活性分别增加了22．6％和72．8％；其细胞膜中C19cyc11的相对含量分别提高了10．0％和36．8％；其细胞膜U／S值分别提高了20．4％和45．2％。故ATB培养基培养所得菌体，由于自我酸胁迫反应，增强了其对葡萄酒胁迫因素及冷冻干燥的抗性，而该反应与H+-ATP酶活性增强和菌体细胞膜脂肪酸组分的变化密切相关。（2）与ATB和MATB培养基相比，FMATB培养基培养获得的菌体，其菌体生长速率分别增加了12．1％和94．5％，其细胞内MLE活性分别增加了33．9％和7．1％。故混合添加有葡萄糖、果糖、苹果酸的FMATB培养基，有利于菌体生长速率及MLF活性的提高。（3）通过比较酸胁迫条件下，酒酒球菌SD-2a在三种培养基中的最大生长速率和最大OD600值，选择FMATB培养基为酸胁迫处理用培养基。在FMATB培养基条件下，酸胁迫处理降低了酒酒球菌SD-2a菌体的生长速率，且对菌体细胞产量有一定影响，其中，pH3．2处理所获菌体细胞产量约为对照的70％。但酸胁迫处理显著增强了菌体的接种存活率，其中pH3．2处理的菌体接种存活率比对照提高了近9倍。pH3．5和pH3．2处理均能使菌体顺利启动模拟酒培养液的MLF。且酸胁迫处理能显著提高菌体的冻干存活率，其中，pH3．5和pH3．2处理所获菌体的冻干存活率分别为对照的2．2倍和1．9倍。故酸胁迫处理是直投式酒酒球菌SD-2a发酵剂生产有效的胁迫处理方式，初步筛选出酸胁迫处理条件应设置在pH3．5～3．2之间。（4）酒酒球菌SD-2a酸胁迫适应性反应机制研究结果表明，酸胁迫处理诱导增强了菌体细胞内MLE活性，其中，pH3．5和pH3．2处理菌体细胞内MLE活性，分别比对照处理提高了23．7％和46．4％；酸胁迫条件诱导增强了菌体H+-ATP酶活性，其中，pH3．5和pH3．2处理分别是对照处理的1．22和1．39倍；酸胁迫处理明显增加了细胞膜中环丙烷型脂肪酸的相对含量，且pH3．5和pH3．2处理与对照相比显著增加了细胞膜U／S值。故菌体在酸胁迫适应过程中，细胞内MLE活性和H+-ATP酶活性的升高，细胞膜环丙烷型脂肪酸的聚集及U／S值增加，应与菌体接种存活率和冻干存活率的提高密切相关。（5）通过比较乙醇胁迫条件下，酒酒球菌SD-2a在三种培养基中的最大生长速率和最大OD600值，选择FMATB培养基为乙醇胁迫处理用培养基。在FMATB培养基条件下，乙醇胁迫处理明显降低了菌体的生长速率和生长量。与酸胁迫处理相比，乙醇胁迫处理对提高菌体的接种存活率及发酵活性，效果不明显。5％乙醇胁迫条件降低了菌体对冷冻干燥的耐受性，而10％乙醇胁迫条件能诱导增强菌体对冷冻干燥的抗性。但总体来讲，乙醇胁迫处理不是直投式酒酒球菌SD-2a发酵剂生产有效的胁迫处理方式。（6）酒酒球菌SD-2a乙醇胁迫适应性反应机制研究结果表明，乙醇胁迫条件诱导增加了菌体细胞内MLE的活性，且乙醇浓度越高，菌体细胞内MLE的活性越高；但乙醇胁迫处理却显著抑制了菌体H+-ATP酶活性；5％乙醇胁迫处理明显增加了细胞膜总饱和脂肪酸的比例，细胞膜U／S值降低；而10％乙醇胁迫处理明显降低了细胞膜总饱和脂肪酸的比例，增加了总不饱和脂肪酸的相对含量，细胞膜U／S值增大。（7）酒酒球菌SD-2a在10％乙醇胁迫条件下，菌体的生长速率和生长量随着培养基中苹果酸含量增加而增大。菌体生理状态测定结果表明，随着培养基中苹果酸含量的增加，菌体细胞内MLE活性显著增加，且菌体细胞膜U／S值显著增加。故在10％乙醇胁迫存在的条件下，MLF途径及细胞膜脂肪酸组分的调整，能增强菌体的乙醇耐受性，提高了菌体在乙醇胁迫环境中的生长能力。（8）处于稳定前期的酒酒球菌SD-2a菌体，其冻干存活率高于处于指数中期的菌体。酸胁迫条件和培养基组分都显著影响着菌体的冻干存活率，且两因素间的交互作用极显著。（9）脂肪酸组分与冻干存活率间具有较强的相关关系，其中C16：0与冻干存活率间存在显著负相关，C19cyc11与冻干存活率之间存在显著正相关。故认为增加细胞膜中C19cyc11的相对含量是酒酒球菌抗冷冻干燥机制之一。（10）本文的创新点：初次以本土酒酒球菌菌株为试材，进行了酒酒球菌酸、乙醇胁迫适应性反应机制的研究；本文提出在酒酒球菌SD-2a培养过程中，诱导其发生酸胁迫适应性反应可有效提高菌体的存活率，该结论为该菌直投式发酵剂的制备提供了理论支持；首次对酒酒球菌抗冷冻干燥机制进行了初步研究。
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相关论文文献
- [1].直投式酒酒球菌SD-2a发酵剂对葡萄酒品质的影响[J]. 西北农林科技大学学报(自然科学版) 2016(12)
- [2].酒酒球菌SD-2a原生质体制备的研究[J]. 中国酿造 2009(07)
- [3].不同培养基对酒酒球菌SD-2a存活率及膜脂肪酸组分的影响[J]. 微生物学报 2008(10)
- [4].乙醇胁迫处理对酒酒球菌SD-2a生理特性的影响[J]. 微生物学通报 2011(01)
- [5].酒类酒球菌SD-2a活性干粉与国外干粉生产性能比较[J]. 酿酒 2008(04)
- [6].酒酒球菌SD-2a的β-D-葡萄糖苷酶活性研究[J]. 食品科技 2013(08)