miR-142-3p调控RAC1并抑制肝癌细胞的迁移和侵袭

论文摘要

目的:肝癌的迁移和侵袭是多基因共同参与的一个复杂的生命过程。目前对其机制的研究已取得很多成就。RAC1蛋白是属于Rho家族的小G蛋白（Rho-GTPase）,是重要的细胞内信号分子,在细胞的生长,骨架形成,迁移和侵袭及各种蛋白激酶的激活中起关键的作用。目前研究证实,Rho蛋白特别是RAC1在肿瘤迁移、侵袭等恶性生物学行为中起重要作用,在肝癌、胃癌、结肠癌、乳腺癌、肺癌等均报道有RAC1表达的异常增高。微小RNA（microRNA,miRNA）是一类非编码调控单链小分子RNA,能够通过与靶mRNA的3’UTR区特异性的碱基配对结合对靶基因翻译的抑制或mRNA的降解来进行转录后水平调控。这些miRNA通过调控其靶基因的表达水平,在肿瘤发生和发展过程中发挥极其重要的作用。此研究的目的是探寻miRNA能否通过RAC1蛋白来参与肝癌细胞的迁移和侵袭的调控过程。方法:首先用生物信息学方法筛选以RAC1为靶的候选miRNA-miR-142-3p,利用荧光报告载体实验验证miR-142-3p对RAC1的直接调控作用。通过Real-time RT-PCR和Western blot方法在肝癌细胞系检测了miR-142-3p对RAC1的mRNA和蛋白水平的影响。并用Real time RT-PCR方法和免疫组化方法在肝癌组织和癌旁正常组织中进一步验证miR-142-3p对RAC1的调控关系。然后在人肝癌细胞系细胞中,利用WST-1实验、集落形成实验和Tanswell实验检测（过表达miR-142-3p或封闭miR-142-3p后）肝癌细胞系表型的变化。最后利用挽救实验过表达RAC1和RNA干扰技术沉默RAC1后,用WST-1实验、集落形成实验和transwell实验检测了细胞表型的变化。结果:miRNA筛选结果表明,miR-142-3p是靶定RAC1的miRNA,其3’非翻译区包含miR-142-3p的潜在结合位点。荧光报告载体实验证实,miR-142-3p能够通过作用于RAC1基因的3’非翻译区对其表达进行负性调节。Real-time RT-PCR和Western blot的结果表明miR-142-3p能够影响RAC 1 mRNA和蛋白的表达水平。与正常肝组织相比,肝癌组织内miR-142-3p的表达明显降低,而RAC1的mRNA和蛋白水平明显增高。在肝癌细胞系中,过表达miR-142-3p后,细胞生长活性未受影响,集落形成能力明显降低;迁移和侵袭能力也明显下降;封闭了 miR-142-3p之后结果相反。在QGY-7703细胞中,挽救RAC1与封闭miR-142-3p对细胞的表型影响一致,而沉默RAC1后与过表达miR-142-3p对细胞的表型影响一致。结论:在此研究中我们验证了 miR-142-3p是人类RAC1蛋白的负性调控因子。在肝癌细胞中,miR-142-3p能够抑制细胞长期增殖和促进迁移和侵袭能力但不影响细胞的短期活性,起到抑癌基因的作用。肝癌组织中miR-142-3p异常低表达使得肿瘤相关基因RAC1的表达水平升高,使RAC1的促增殖及迁移和侵袭能力增强。通过阐明miR-142-3p在肝癌中的具体作用机制有利于我们对恶性肿瘤的发生和发展进行深入的了解,同时也为肿瘤的诊断和治疗提供新依据。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 符号说明
• 前言
• 研究现状、成果
• 研究目的、方法
• 一、在肝癌中靶定RAC1的miRNA的筛选及验证
• 1.1 材料和方法
• 1.1.1 实验材料
• 1.1.2 实验方法
• 1.2 结果
• 1.2.1 靶位点预测
• 1.2.2 pcDNA3/pri-miR-142-3p质粒的构建
• 1.2.3 EGFP报告载体的构建
• 1.2.4 RAC1是miR-142-3p的直接靶基因
• 1.2.5 转染pcDNA3/pri-miR-142-3p和ASO-miR-142-3p的QGY-7703细胞中的miR-142-3p表达情况
• 1.2.6 QGY-7703细胞系中miR-142-3p对RAC1 mRNA水平的影响
• 1.2.7 miR-142-3p对RAC1蛋白水平的影响
• 1.2.8 Real-time RT-PCR检测miR-142-3p和RAC1在肝癌组织和正常肝组织中的差异表达
• 1.2.9 免疫组化检测RAC1在肝癌组织和正常肝组织中的差异表达
• 二、miR-142-3p对原发性肝癌细胞生长,迁移,侵袭的影响的研究
• 2.1 材料和方法
• 2.1.1 实验材料
• 2.1.2 实验方法
• 2.2 结果
• 2.2.1 miR-142-3p对细胞活性的影响
• 2.2.2 平板克隆形成实验
• 2.2.3 miR-142-3p对QGY-7703和SMMC-7721细胞迁移能力的影响
• 2.2.4 miR-142-3p对QGY-7703和SMMC-7721侵袭能力的影响
• 三、RAC1在肝癌细胞中的作用研究
• 3.1 材料和方法
• 3.1.1 实验材料
• 3.1.2 实验方法
• 3.2 结果
• 3.2.1 pSilencer/sh-RAC1和pcDNA3-RAC1质粒的构建和验证
• 3.2.2 RAC1对肝癌细胞生长活性的影响
• 3.2.3 RAC1对肝癌细胞集落形成能力的影响
• 3.2.4 RAC1对肝癌细胞迁移和侵袭能力的影响
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 发表论文和参加科研情况说明
• 综述 小RNA的发育和疾病
• 综述参考文献
• 致谢