T7噬菌体衣壳蛋白P11的表达纯化及单克隆抗体的制备

论文摘要

T7噬菌体是一种感染大肠杆菌的烈性噬菌体,基因组为线状双链DNA,全长39 936bp。其衣壳蛋白包括头蛋白P10A、次要头蛋白P10B、颈圈蛋白P8、尾蛋白P11、P12和尾丝蛋白P17。T7噬菌体作为一种常见的展示系统,因其具有载体容量大,插入片段稳定,洗涤条件灵活,生长周期短等优点而被广泛使用。T7噬菌体蛋白芯片是近年来发展起来的一种新的蛋白质检测手段,具有高质量、高灵敏度、高特异性且微型化特点的一种蛋白质分析技术,能使外源蛋白表达并展示于T7噬菌体表面,再将这些展示外源蛋白的T7噬菌体固化在芯片上,对其展示的蛋白进行检测。本试验根据GenBank发表的P11基因序列,设计了一对特异性核苷酸引物,用PCR方法获得598bp大小的基因片段,并将其克隆到表达载体上,测序鉴定,成功构建pET-28a（+）/P11表达载体,转化到大肠杆菌表达菌株BL21（DE3）中,诱导表达重组蛋白P11,并进一步通过Ni-NTA亲合层析柱纯化目的蛋白,纯化率达90%。纯化产物经SDS-PAGE鉴定后免疫Balb/c小鼠,用聚乙二醇PEG介导Balb/c小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,用纯化的P11重组蛋白筛选阳性杂交瘤细胞株,对阳性克隆细胞株经3次有限稀释法克隆化筛选后,最终获得1株能稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株,命名为2G11。对单克隆抗体亚类鉴定结果表明2G11为IgG2b亚类。ELISA试验结果和Western blot分析表明,单抗能与T7噬菌体蛋白和P11蛋白特异结合。这为进一步研究P11蛋白的结构和功能,提高T7噬菌体蛋白芯片的筛选效率以及建立噬菌体检测方法奠定了基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 文献综述
• 第一章 单克隆抗体技术及噬菌体蛋白芯片研究进展
• 1.1 单克隆抗体技术及其研究进展
• 1.2 噬菌体蛋白芯片研究进展
• 1.2.1 噬菌体的种类
• 1.2.2 噬菌体展示系统的分类
• 1.2.3 噬菌体展示肽库的应用
• 1.2.4 噬菌体蛋白芯片的发展概况
• 1.2.5 蛋白芯片研究进展
• 试验部分
• 第二章 P11 蛋白的原核表达与纯化
• 2.1 材料
• 2.1.1 质粒和菌株
• 2.1.2 主要试剂
• 2.1.3 常用溶液配制
• 2.1.4 主要仪器
• 2.2 方法
• 2.2.1 重组原核表达载体的pET-28a（+）/P11 构建及鉴定
• 2.2.2 P11 蛋白的原核表达
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 P11 蛋白表达载体的构建
• 2.3.2 P11 蛋白的表达、纯化
• 2.4 讨论
• 2.5 小结
• 第三章 P11 单克隆抗体制备及初步鉴定
• 3.1 材料
• 3.2 方法
• 3.2.1 动物免疫
• 3.2.2 制备单克隆抗体细胞株
• 3.2.3 阳性克隆的扩大培养及冻存
• 3.2.4 腹水制备及抗体效价测定
• 3.2.5 腹水的纯化
• 3.2.6 蛋白浓度的测定
• 3.2.7 腹水效价的测定
• 3.2.8 单克隆抗体分型检测
• 3.2.9 单克隆抗体的特异性鉴定
• 3.3 结果
• 3.3.1 鼠抗P11 杂交瘤细胞株的建立
• 3.3.2 单克隆抗体的效价
• 3.3.3 单克隆抗体蛋白浓度的测定
• 3.3.4 单克隆抗体亚类的测定
• 3.3.5 单克隆抗体活性的初步鉴定
• 3.4 讨论
• 3.5 小结
• 结论
• 参考文献
• 致谢
• 作者简介