MicroRNA在非小细胞肺癌耐药细胞株A549/DDP中表达及作用机制的研究

论文摘要

背景和目的:microRNA （miRNA）是在真核生物中发现的一类小分子非编码RNA,在转录后水平调节基因表达。研究表明,miRNA作为类似癌基因和抑癌基因作用参与细胞增殖、凋亡和分化的调控,在肿瘤的发生发展过程中发挥着重要的生物学作用,且可能与肿瘤的耐药性密切相关。顺铂是非小细胞肺癌（NSCLC）化疗的一线药物,但其获得性耐药制约了其疗效的发挥。本实验通过miRNA表达谱芯片技术,检测顺铂耐药的NSCLC细胞株与敏感株中miRNA表达的差异,筛选出与NSCLC顺铂耐药相关的miRNAs表达谱。并进一步探讨miRNA在NSCLC顺铂耐药中的作用机制,进而为miRNA作为NSCLC顺铂耐药诊断和预后的标志物及基于miRNA的NSCLC逆转顺铂耐药治疗策略提供理论依据。方法:（1）MTT法检测A549/DDP相对于其亲本细胞A549对顺铂的耐药性和耐药倍数;（2）分别提取两种细胞的总RNA,并进行质检;microRNA芯片检测NSCLC细胞株A549及其对应的顺铂耐药株A549/DDP中miRNA表达差异;（3）设计并合成miRNA特异性引物,采用real time PCR验证芯片结果。（4）探讨miR-21对肺癌细胞株顺铂敏感性的影响:miRNA前体转染A549细胞株,anti-miRNA寡聚核苷酸转染A549/DDP细胞株,分别使miR-21在A549中表达增高,而在A549/DDP中表达降低,同时分别设立阴性对照组及空白对照组,MTT法测定转染后的两株细胞对顺铂的药物敏感性。（5）转染24h后,提取细胞总RNA,real time PCR测定转染后A549和A549/DDP中mir-21的表达量（。6）运用TargetScan、miRanda、PicTar软件预测miR-21可能调控的靶基因（。7）western blot验证miR-21的靶基因:转染48h后,提取细胞总蛋白,western blot的方法检测Bcl-2蛋白和PTEN蛋白的表达。结果:（1）顺铂对A549和A549 /DDP细胞的IC50值分别为7.47μmol /L和137.32μmol /L,两者之间差异有统计学意义（P<0.01）,耐药倍数为18.38倍。（2）从A549和A549/DDP中提取到的总RNA纯度高,完整性好。microRNA芯片结果显示耐药株A549/DDP与亲本细胞株A549比较有34条有差异表达的miRNA（差异比值﹥1.5倍或﹤0.67倍, P<0.05）;（3）real time PCR的结果进一步证实miR-21,miR-31,miR-374在A549/DDP中显著上调,而miR-378,miR-886-5p,miR-886-3p,miR-520c-3p在A549/DDP中显著下调。（4）体外药物敏感试验中发现,反义抑制mir-21使细胞对顺铂的敏感性明显增加,实验组较对照组IC50降低了23%（P<0.05）;而使mir-21过表达可导致细胞对顺铂产生耐药性,实验组较对照组IC50增加了103%（P<0.05）。（5）转染24h后, real time PCR测定A549实验组中mir-21的表达比对照组增加了16倍（P<0.01）,A549/DDP实验组中mir-21的表达比对照组减少了20倍（P<0.01）。（6）在转染miR-21反义寡核苷酸的A549/DDP细胞中,相对于未转染组和对照组,观察到凋亡抑制蛋白Bcl-2表达下调,PTEN表达上调;在转染miR-21前体的A549细胞中,相对于未转染组和对照组,观察到凋亡抑制蛋白Bcl-2表达上调,而PTEN表达下调。结论:（1）A549/DDP与A549细胞株miRNA的表达谱存在着差异,提示miRNA可能参与NSCLC顺铂耐药;（2）体外药物敏感试验中发现,反义抑制miR-21使细胞对顺铂的敏感性明显增加,减轻了肿瘤耐药;而使miR-21过表达可导致细胞对顺铂产生耐药性。（3）miR-21可能通过调控Bcl-2和PTEN的表达介导了NSCLC细胞的顺铂耐药。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 前言
• 材料和方法
• 结果
• 分析与讨论
• 结论
• 参考文献
• 综述
• 参考文献
• 附录
• 在读期间发表的文章
• 致谢