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NGAL相互作用蛋白的筛选与鉴定

2020-11-21阅读(366)

NGAL相互作用蛋白的筛选与鉴定

论文摘要

Lipocalins是一个细胞外蛋白家族,常作为疏水小分子转运的载体,能与细胞表面的受体相互作用。NGAL（neutrophil gelatinase-associated lipocalin）是lipocalins家族成员之一。以往的研究表明,NGAL可能参与多种生命活动过程,包括胚胎发育、细胞分化、炎症免疫反应、细胞凋亡、信号转导、脂质代谢、肿瘤的发生发展等。我们课题组曾研究发现,NGAL在人永生化食管上皮细胞恶变过程中过表达,具有促进癌细胞侵袭功能,同时还可能参与癌细胞的不良分化。目前,NGAL在细胞内的具体生化作用机制还不明了。本文的目的是从人类骨髓预转化cDNA文库中寻找与NGAL相互作用的蛋白,构建蛋白-蛋白相互作用图谱,为揭示NGAL的生化作用机制提供一条新途径。主要研究内容和方法:一、利用酵母双杂交技术,筛选出与NGAL相互作用的目标蛋白,并给予验证。二、用免疫共沉淀方法,在体外和哺乳动物细胞内验证目标蛋白与NGAL的相互作用。三、用荧光素酶双报告系统进一步验证目标蛋白与NGAL的相互作用。主要研究结果:一、酵母体内一对一验证66个文库质粒基因表达蛋白与NGAL的相互作用,得到40个阳 性克隆,测序,并在NCBI公共数据库进行BLAST分析。最终获得31个基因,11个 未知,20个已知。二、构建17对用于免疫共沉淀的质粒,这些外源基因包括大T抗原和p53、NGAL及文库 质粒上的基因片段X等,分别插入到pCMV-HA和pCMV-Myc载体。在哺乳动物细 胞内成功建立了免疫共沉淀技术平台。三、利用protein-A-agarose纯化免疫兔血清,分离得到NGAL抗体。证明该抗体可以用于 免疫检测或免疫共沉淀NGAL。四、免疫共沉淀结果表明,NGAL和Galeetin-1之间可能存在弱相互作用。五、运用哺乳动物细胞双杂交系统研究发现, 在哺乳动物细胞中NGAL可能以某种特殊 方式与Galectin-1相互作用。结论:1获得了31个可能与NGAL具有相互作用关系的候选蛋白。2验证候选蛋白之一galectin-1与NGAL之间的相互作用,提示初步阳性结果,但还需进一步证明。

论文目录

  • 中文摘要
  • 英文摘要
  • 缩列语
  • 目录
  • 前言
  • 第一部分 酵母双杂交技术一对一验证与NGAL相互作用的蛋白
  • 1 材料方法
  • 2 结果
  • 3 讨论
  • 第二部分 哺乳细胞中免疫共沉淀实验验证目标蛋白与 NGAL的相互作用
  • 1 材料方法
  • 2 结果
  • 3 讨论
  • 第三部分 哺乳细胞中双荧光素酶报告系统验证目标蛋白与NGAL的相互作用
  • 1 材料方法
  • 2 结果
  • 3 讨论
  • 小结
  • 参考文献
  • 附图
  • 文献综述
  • 附录1: 发表的文章
  • 附录2: 试剂配制
  • 附录3: 测序图谱
  • 致谢

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