双菌转化RSA制氢化可的松新工艺的研究

论文摘要

氢化可的松（Hydrocortisone, HC）作为重要的肾上腺皮质激素药物和高档甾体药物的合成原料,这一特性一直以来都吸引着国内外企业界和学术者的广泛关注。应用于工业生产HC的菌种,国内主要为蓝色犁头霉（Absidia coerulea）,国外为新月弯孢霉（Curvularia lunata）。二者在生产HC的过程中,各具特点。蓝色犁头霉对底物RSA（17α-羟基孕甾-4-烯-3,20-二酮-21-醋酸酯）具有较高的脱乙酰活性和氧化活性,但由于氧化专一性差,副产物量相对较高,产物的分离精制难。HC对RSA的收率仅为45%,对薯蓣皂素的总收率约为19%。新月弯孢霉氧化专一性较好,副产物量较少,但脱乙酰活性相对较弱,以RS（17α,21-二羟基孕甾-4-烯-3,20-二酮）投料,收率可达55%-60%。本文以现行工业生产HC产率和底物投料方式为对照,采用蓝色犁头霉和新月弯孢霉为菌种,通过工艺方法和底物投料方式的改进,寻找有效提高HC收得率和底物投料浓度的工艺途径。本文利用蓝色犁头霉（Absidia coerulea AS 3.65）和新月弯孢霉（Curvularia lunata AS 3.4381） （=ATCC 12017=NRRL 2380）为出发菌株,通过自然选育的筛选方法,获得相对高活性A. coerulea和C. lunata,传代5-7代,4℃保存,备用。通过对两菌摇瓶初、复筛过程的比较考察,二者发酵特性与前描述相符。为更好发挥二者各自的优点,以协同转化为基础,RSA（4%乙醇体系）为投料底物体系,构建两菌分别培养顺序转化、两菌分别培养同时转化和两菌混合培养与转化三种方案,得到较佳方案为顺序转化。通过对菌丝体投加时间、菌体量和投料负荷的考察,确定出最佳的转化条件—两菌二级接种均为5%（v／v）,磷酸缓冲液（pH 6.0）包含底物的转化介质中,A. coerulea先行转化20h时,添加C. lunata构成协同转化体系,并且此体系在首轮投料浓度分别为2g/L和1g/L时,能分别反复利用3和6轮。这较A. coerulea和C. lunata单菌转化,有效地抑制了14α-羟化副产物和其他副产物的产生。在摇瓶实验的水平上,HC产率可高达81.6%（HPLC测得数据）。为进一步提高投料浓度,本文采用相关文献报道常用于甾体转化的有机溶剂为介质,以单菌和协同菌丝体为生物催化剂,筛选到对生物稳定性影响较弱的有机溶剂丙三醇。并通过添加表面活性剂吐温80和对底物体系的前处理方式的考察,建立的Tween80/丙三醇／RSA（1.0／3.0／1.0,v／v／w）底物添加体系使得投料浓度高达5 g／L时,双菌转化体系在104 h内,仍能定量转化底物,得到高产率的HC。且在以3g/L为初始投料的摇瓶放大实验中,协同转化体可重复利用2-3轮,生成的目标产物平均收率达52%。此投料方法较国内现行业所使用投料方式下的产物收率45-47%高出7-5%。可见,建立的底物添加体系比较适合RSA制HC现有国内产业体系的工艺改进,可应用性及技术集成度强,对提升我国甾体激素HC的生产技术水平很有参考价值。另外,所建立的新型底物投料体系Tween80/丙三醇／RSA（1.0／4.0／1.0,v／v／w）被用于单菌C.lunata转化时,C.lunata呈现出较强的脱乙酰活性,且HC产率维持在较高水平。以2 g／L进行投料,5L发酵罐连续2轮和5L摇瓶放大的制备实验,平均收率达53.3%。可见,在合适的投料介质体系中,新月弯孢霉对底物RSA仍能表现出较佳的脱乙酰活性。此途径减少了RSA→RS的化学步骤,节能降耗且环保的特性赋予了其较强的工业应用价值潜力。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 文献综述
• 1 甾体化合物简介
• 2 甾体化合物的生物转化
• 2.1 甾体生物转化类型
• 2.2 甾体微生物转化常遇到的问题
• 2.2.1 底物的溶解性
• 2.2.2 细胞壁膜的阻碍作用
• 2.3 甾体微生物转化一般方法
• 3 微生物对甾体11β-羟基化的研究概况
• 3.1 氢化可的松的结构、性质及作用
• 3.2 微生物甾体11β-羟化反应
• 3.3 进行甾体11β-羟化反应的微生物
• 4 研究目的及内容
• 参考文献
• 第一章 菌株筛选
• 1 材料
• 1.1 菌种
• 1.2 培养基
• 1.3 药品与试剂
• 1.3.1 甾体
• 1.3.2 主要试剂
• 1.3.3 主要仪器
• 2 实验方法
• 2.1 菌种活化
• 2.2 高产菌株筛选
• 2.3 甾体底物的制备
• 2.3.1 A.coerulea AS 3.65的反应底物
• 2.3.2 新月弯孢霉的反应底物
• 2.4 转化过程中的分析检测
• 2.4.1 薄层层析法（TLC）
• 2.4.2 半定量分析方法
• 3 结果与讨论
• 3.1 菌株的分离活化
• 3.2 TLC分析
• 3.3 高活性菌株筛选
• 4 小结
• 参考文献
• 第二章 双菌多轮序列协同转化甾体RSA制氢化可的松
• 1 材料与方法
• 1.1 菌种
• 1.2 培养基
• 1.3 仪器及试剂
• 1.4 实验方法
• 1.4.1 菌丝体的制备
• 1.4.2 转化底物的制备
• 1.4.3 生物转化-摇床实验
• 1.5 分析方法
• 2 结果与讨论
• 2.1 协同转化工艺
• 2.1.1 协同转化组合的选择
• 2.1.2 Ⅱ级接种量和菌丝体2投加时间对转化的影响
• 2.1.3 菌丝体对甾体的吸附考察
• 2.1.4 单菌转化与双菌协同转化的比较
• 2.2 协同生物催化剂多次重复使用的性能考察
• 2.2.1 首轮转化投料浓度对转化率的影响
• 2.2.2 协同菌丝体转化多轮批次试验
• 3 结论
• 参考文献
• 第三章 生物转化RSA制氢化可的松:改进底物添加体系
• 1 材料与方法
• 1.1 菌种
• 1.2 试剂及药品
• 1.3 培养基
• 1.4 方法
• 1.4.1 生物催化剂的制备
• 1.4.2 有机溶剂的选择
• 1.4.3 放大制备实验
• 1.5 分析方法
• 2 结果与讨论
• 2.1 不同有机溶剂对生物转化的影响
• 2.2 转化体系的再优化选择
• 2.2.1 底物前处理方式对协同转化的影响
• 2.2.2 Tween80/有机溶剂/RSA（v/v/w,mL/mL/g）比例对转化的影响
• 2.3 底物添加体系对RSA负荷量的考察
• 2.4 游离协同催化体系在Tween80/丙三醇转化介质中多次利用考察
• 2.5 协同菌丝体在Tween80/丙三醇转化介质中的放大制备试验
• 3 小结
• 参考文献
• 第四章 改进底物体系应用于新月弯孢霉转化RSA制HC
• 1 材料与方法
• 1.1 微生物
• 1.2 试剂及药品
• 1.3 培养基
• 1.4 方法
• 1.4.1 甾体底物的制备
• 1.4.2 菌丝体的制备及生物转化
• 1.4.3 产物的提取分离及精制
• 1.5 分析方法
• 2 结果与讨论
• 2.1 不同投料方式对转化的影响
• 2.2 吐温8/0丙三醇/RAS（vv//）w浓度比例对转化的影响
• 2.3 菌体量对生物转化的影响
• 2.4 底物浓度对转化的影响
• 2.5 最佳转化时间的确立
• 2.6 转化轮次的考察
• 2.7 C.lunataAS 3.4381转化RSA的制备实验
• 3 小结
• 参考文献
• 全文总结
• 展望
• 致谢
• 在读期间科研成果