论文摘要
背景动脉粥样硬化致病机理一直是心血管领域的研究热点,先后有血栓形成学说、炎症学说、脂质浸润学说、单克隆学说、损伤反应学说、氧化学说、同型半胱氨酸学说以及精氨酸学说。Pober和Cotran在大量血流动力学与动脉粥样硬化关系的研究成果基础上,提出了动脉粥样硬化发病学的剪切力学说（shear stresshypothesis）,认为血流剪切力异常是促使动脉粥样硬化病变形成的重要原因之一。根据血管内皮细胞精细调节多种“血管保护”效应分子的反应能力和流体机械力调节内皮细胞基因表达的潜能,剪切力学说认为,均匀的层流剪切力可选择性地诱导内皮“动脉粥样硬化保护性基因”的表达,从而作用于局部以抵消全身性危险因素的有害作用。血流动力学因素异常出现层流剪切力不均匀,内皮细胞分泌抗动脉粥样硬化分子减少,高胆固醇血症、高半胱氨酸血症等危险因素的持续作用可促使动脉粥样硬化病变的发生。显然,动脉粥样硬化灶性分布特点主要由血流动力学因素介导的血管易损性程度所决定。该定位分布特点在人体和实验动物均已得到证实,这有力地说明剪切力与动脉粥样硬化病变发生部位的紧密关系。研究表明人的动脉管壁处于生理剪切力区域（剪切力≥12dyne/cm2）有抑制动脉粥样硬化形成的保护性作用,而低剪切力区域（剪切力≤4dyne/cm2）有促动脉粥样硬化形成作用。膜型基质金属蛋白酶1（membrane type-1 matrix metalloproteinase,MT1-MMP,MMP-14）是唯一锚定于细胞膜上的胶原蛋白酶,其底物广泛包括:胶原,纤连蛋白,层连蛋白,弹性蛋白,纤溶酶原等。实验表明MT1-MMP可以通过促进单核细胞迁移、降解细胞外基质包括胶原等,促进易损斑块的发生和发展。新近实验通过选择性基因敲除和过表达两个方面证实,MT1-MMP通过影响斑块胶原纤维含量在易损斑块的形成过程中起到重要作用。已有实验证实,低剪切力可以上调MMP-2和MMP-9的表达,同时增加其活性,MT1-MMP可以通过活化MMP-2和MMP-9前胶原形式增加其活性。然而,低剪切力与MT1-MMP的关系尚未明了。因此我们提出了这样的假设:低剪切力可诱导MT1-MMP的表达,从而参与动脉粥样硬化斑块的形成。研究目的:1.在低剪切力动物模型中,观察低剪切力对MT1-MMP的作用。2.在体外细胞研究中,明确低剪切力与MT1-MMP的关系。研究方法1.动物模型20只8-10周龄雄性ApoE-/-小鼠,均给予高脂饮食（含0.25%胆固醇和15%脂肪）喂养。通过缩窄性颈总动脉套管建立ApoE-/-小鼠左侧颈总动脉低剪切力动脉粥样硬化斑块模型,右侧颈总动脉假手术对照。2.显微超声测量应用显微超声技术测量小鼠左侧和右侧颈总动脉最大内膜中层厚度（IMT）,收缩期内径（Ds）,近心端最大血流速度（Vmax）。根据公式τ（N/m2）=4·Vma·η/Ds,η是血液粘滞系数（采用η=0.035）计算小鼠左右两侧颈总动脉剪切力（τ）。3.病理学检测8周末应用过量戊巴比妥钠注射使小鼠安乐死后,PBS液体灌洗血管,继之灌注4%的多聚甲醛固定液。分离左侧颈总动脉和右侧颈总动脉,取材后标本置于4%的多聚甲醛固定液中浸泡固定12小时,OCT包埋,制作5um冰冻切片,标本每间隔50um即连续切片20张,苏木素-伊红染色。其它相邻切片做免疫组化检测MT1-MMP的分布和含量。4.体外人脐静脉内皮细胞培养及鉴定4.1人脐静脉内皮细胞的原代培养与传代无菌获取剖宫产新生儿脐带15-20cm,冲洗脐静脉管腔。将脐带另一端用止血钳夹闭,注入胰酶于超净台上室温消化5-7 min。将胰酶抽出,置于离心管内,再冲洗管腔,洗出液置于离心管内,加入胎牛血清终止消化。离心10min,于超净台上将离心管内的上清液倒掉,以全培养基将细胞重新悬浮,转移至培养瓶内,置于孵箱中培养,12-24h后换液,清除未贴壁细胞。4.2传代待原代细胞融合成单层后,用PBS将细胞洗两遍,以去除血清,加入0.25%胰酶2 ml,孵箱内消化3-5min,在倒置相差显微镜下观察见细胞变成圆形,吸出胰酶,加入培养基,轻轻吹打,待细胞全部悬浮,按105个/ml分装,放回37℃孵箱中继续培养。4.3内皮细胞鉴定免疫荧光法检测CD31、CD34和Ⅷ因子:HUVECs接种于预先置于细胞培养板内的盖玻片上,至细胞长成单层,弃培养液,PBS洗3次,加入95%乙醇固定30min,PBS冲洗,采用免疫荧光染色,滴加相应抗体血清,再滴加1:40荧光素标记的羊抗兔疫荧光抗体,设阴性及空白对照。荧光显微镜下观察、拍片。5.内皮细胞剪切力干预分组5.1不同作用时间下,低剪切力对脐静脉内皮细胞表达MT1-MMP mRNA及蛋白质活性的影响1)静态对照组:不给予剪切力,细胞在静态下培养。2)低剪切力1小时组:给予低剪切力（4 dyne/cm2）作用1小时,以观察MT1-MMP mRNA及蛋白质活性的变化。3)低剪切力3小时组:给予低剪切力（4 dyne/cm2）作用3小时,以观察MT1-MMP mRNA及蛋白质活性的变化。4)低剪切力5小时组:给予低剪切力（4 dyne/cm2）作用5小时,以观察MT1-MMP mRNA及蛋白质活性的变化。5.2相同作用时间下,不同剪切力对脐静脉内皮细胞表达MT1-MMP mRNA及其蛋白质活性的影响1)静态对照组:细胞不给予任何剪切力。2)低剪切力组:给予低剪切力（4 dyne/cm2）分别作用1、3、5小时,观察低剪切力对MT1-MMP mRNA及蛋白质活性的影响。3)生理剪切力组:给予生理性剪切力（12 dyne/cm2）分别作用1、3、5小时,观察低剪切力对MT1-MMP mRNA及蛋白质活性的影响。6.实时定量RT-PCR根据试剂盒说明,以Trizol自HUVECs中提取总RNA。用M-MLV试剂盒进行逆转录。于Light Cycler上实行实时定量PCR。每个样本重复三次测量。MT1-MMP扩增引物:上游5’-ACGTGCAGCAGCATTGGA-3’,下游5’-CAACAGGAGCAAGTGTGCCTTC-3’;β-actin扩增引物,上游5’-TGGACATCCGCAAAGAC-3’,下游5’-GAAAGGGTGTAACGCAACTA-3’。反应结束得到循环阈值（Ct值）,用相对定量的方法(2-ΔΔCt)来分析数据。MT1-MMP mRNA表达以管家基因β-actin进行标化。7.Western Blot分析收集细胞后,提取总蛋白,煮沸5分钟。以SDS-PAGE电泳,然后转膜,封闭,洗膜三次。以适当浓度的一抗4℃过夜后,洗膜。二抗孵育、洗膜,最后采用增强化学发光法观察结果。8.MT1-MMP活性测定收集细胞后,加入适量蛋白提取液,收集上清液待查。吸取待测蛋白以及蛋白标准品加入96孔板中,轻轻摇晃20s,4℃孵育过夜。洗板4次,每孔滴加结合液50ul,混匀,滴加50ul反应试剂,摇晃20s混匀,在405nm读取t0值。37℃孵育2.5h,摇晃20s,405nm读取t值。由标准品浓度根据浓度和（t-t0）×1000/6.25呈线性关系描绘标准曲线,由标准曲线得出待测值。9.统计分析实验结果以均数士标准误表示。应用SPSS13.0软件进行分析,两两比较采用t检验,多组之间采用单因素方差分析,P<0.05为差异具有统计学意义。结果:1.动物基本特点20只实验动物,其中1只死于手术前麻醉,其他各只动物全部完成实验。2.显微超声测量结果左侧颈总动脉IMT明显大于右侧颈总动脉IMT（P<0.05）,左侧颈总动脉近心端有明显斑块形成,而右侧颈总动脉未检测明显斑块,仅有内膜毛糙现象。根据Ds与Vmax计算得出,左侧剪切力比右侧剪切力低30%（P<0.05）。3.病理学检测结果左侧颈动脉近心端形成明显的斑块,管腔明显狭窄,而右侧仅有动脉增厚,未见明显斑块。免疫组织化学显示MT1-MMP在左侧颈总动脉表达明显升高。4.人脐静脉内皮细胞鉴定应用兔抗人CD31、CD34和Ⅷ抗体,根据免疫荧光检测结果,显示体外培养内皮细胞纯度可达95%以上。5.不同作用时间下,低剪切力对脐静脉内皮细胞表达MT1-MMP mRNA及蛋白质的影响将HUVECs暴露于低剪切力1小时,MT1-MMP mRNA的水平与静态时比有明显升高（P<0.01）,但当分别作用3、5小时,MT1-MMP mRNA表达增高更加明显。Western Blot和ELISA结果显示,低剪切力作用于HUVECs 1小时,蛋白质量及活性无明显变化（P>0.05）,3和5小时后,蛋白表达量及活性水平比静态时明显升高（P<0.01）。6.相同作用时间下,不同剪切力对脐静脉内皮细胞表达MT1-MMP mRNA及蛋白质的影响实时定量RT-PCR显示,生理剪切力作用1h后,MT1-MMP mRNA水平比静态对照组无明显变化,但比低剪切力组表达降低（P<0.01）,然而生理性剪切力作用3h和5h后,其水平比静态对照组明显降低（P<0.01）。生理剪切力作用1h后,Western Blot和ELISA发现MT1-MMP mRNA蛋白质表达及活性,与静态对照组相比,蛋白质表达量和活性未见明显下降（P>0.05）;与低剪切力组相比,蛋白质表达量和活性明显下降（P<0.01）。生理剪切力作用3h和5h后,与静态对照组和低剪切力组相比,蛋白质表达的量和蛋白质活性具有明显的降低（P<0.01）。结论:1.在ApoE-/-小鼠低剪切力模型中,低剪切力可以上调MT1-MMP的表达。2.在体外研究中,低剪切力上调MT1-MMP的表达,提示低剪切力诱导的MT1-MMP表达上调在动脉粥样硬化斑块发生和/或发展过程中具有重要的作用。背景Pober和Cotran在总结大量研究血流剪切力和动脉粥样硬化之间的关系的研究成果的基础上,提出了动脉粥样硬化发病学的剪切力学说（shear stresshypothesis）,认为血流剪切力异常是促使动脉粥样硬化病变形成的重要原因。血管内皮细胞（Endothelial cell,EC）衬于血管的内壁,直接承受着血液流动产生的剪切力。血流动力学因素异常出现层流剪切力不均匀,内皮细胞分泌抗动脉粥样硬化分子减少,这时高胆固醇血症、高半胱氨酸血症等危险因素的持续作用即可促使动脉粥样硬化病变发生。许多调节因素影响胶原的合成与降解,任一因素的失调均可引起胶原代谢的平衡紊乱。许多研究发现MMPs升高与纤维帽变薄、急性冠脉综合症的发生密切相关。“纤维帽薄,胶原含量少”是典型的易损斑块生物组织学特征之一,这一特点已经得到公认。基质金属蛋白酶（MMPs）在胶原代谢过程中起关键的作用,很多研究显示:MMPs如MMP-2,MT1-PMMP,MMP-13等的表达上调促进细胞外基质包括胶原的降解,导致斑块纤维帽变薄,从而形成易损斑块。近年来锚定于细胞膜的基质金属蛋白酶（MTs-MMP）对易损斑块的作用受到了广泛的关注,其导致易损斑块的机制得到了一定的阐释。膜型基质金属蛋白酶1（MT1-MMP,MMP-14）是唯一锚定于细胞膜上的胶原蛋白酶,其底物广泛,包括:胶原蛋白、纤连蛋白、层连蛋白、弹性蛋白和纤溶酶原等。MT1-MMP促进单核细胞的迁移,进入内膜下吞噬脂质成为泡沫细胞,启动动脉粥样硬化斑块的形成;MT1-MMP溶解细胞周围胶原,促进内皮细胞的迁移,从而促进动脉粥样硬化的发展;MT1-MMP激活MMP-2、9前蛋白成为活性形式,MT1-MMP和被激活的MMP-2、9降解细胞外基质如:胶原等,使得斑块纤维帽变薄,促进易损斑块的发生和发展。由此可见MT1-MMP在易损斑块的发生发展中可能是中心环节。整合素是一组跨膜糖蛋白,是连接细胞外基质与细胞内骨架蛋白的桥梁,能在细胞膜上进行双向的信息传递:来自细胞内的信号可调控整合素与细胞外配体的结合活性,同时,细胞外的信号可通过整合素传递至细胞内,引发细胞的生物学功能的改变。研究证明,整合素是一种机械感受器,依赖整合素的信号传导途径参与了血管内皮细胞对剪切力的反应。整合素可激活胞质内多种蛋白质激酶,如MAPKs、黏附斑激酶（FAK）等,引发细胞内的信号传递过程。丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）是介导细胞反应的重要信号系统,在炎症的发生、发展和细胞因子的生成中起重要的作用。目前哺乳动物细胞中已发现4种MAPK信号分子,即ERK1/2、JNK、p38和ERK5亚家族。我们前期研究表明,MAPK参与了力学信号在细胞内的信号转导过程,介导了MMP-9的高表达,但其与低剪切力诱导的MT1-MMP表达的关系尚不清楚。目前在血管内皮细胞上已发现至少有四种转录因子可被剪切力激活,其中包括核转录因子κB（NF-κB）。研究证明:剪切力促使其亚单位p65向核内转移,调节目的基因表达。上述情况说明,低剪切力能分别激活整合素、丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）、核转录因子κB（NF-κB）,我们第一部分的实验已经表明低剪切力可以诱导内皮细胞高表达MT1-MMP。然而,低剪切力诱导内皮细胞分泌表达MT1-MMP过程中与整合素、MAPKs及NF-κB之间的信号转导关系尚未见报道。研究目的:1.观察低剪切力是否通过上调NF-κB与DNA结合的能力诱导内皮细胞MT1-MMP高表达;2.观察低剪切力是否通过活化ERK1/2或者Akt来上调NF-κB与DNA的结合能力来诱导MT1-MMP高表达;3.观察FAK是否参与低剪切力诱导内皮细胞表达MT1-MMP信号转导过程;4.观察整合素β1在低剪切力诱导内皮细胞表达MT1-MMP的作用。研究方法:1.人脐静脉内皮细胞的原代培养与鉴定采用无菌获取脐带分离脐静脉内皮细胞原代培养的办法获取内皮细胞,具体分离、传代和鉴定方法见第一部分。2.玻片上内皮细胞的种植将经胰蛋白酶消化后的悬浮内皮细胞种植于用明胶处理过的载玻片上,利用流体表面张力将其限制在玻片范围。小心移至CO2孵箱,待细胞贴壁后,在置载玻片的培养皿内加入全M199培养液,隔日换液,用于后续实验.3.流室系统由四川大学华西医学中心生物医学工程实验室设计并提供数据,成都西木子公司承接制造。流室测试区满足:（1）层流;（2）二维流动;（3）充分发展的流动。4.细胞剪切力干预分组4.1 NF-κ3调节低剪切力（4dyne/cm2）介导的HUVECs对MT1-MMP mRNA的表达及其蛋白质活性1)静态组:不给予任何力,也不给予任何抑制剂。2)低剪切力对照组:分别给予HUVECs低剪切力（4dyne/cm2）30分钟、1、3小时,观察在不加NF-κB抑制剂SN50的条件下,低剪切力对p65的DNA结合活性及MT1-MMP mRNA表达及其蛋白质活性的影响。3)SN50组:先予以HUVECs18μM SN50,于孵箱中培养2小时,再给予低剪切力（4dyne/cm2）5小时,观察NF-κB对低剪切力介导的MT1-MMP mRNA表达及其蛋白质活性的影响。4.2 ERK1/2（Akt）对低剪切力（4 dyne/cm2）介导的NF-κB/MT1-MMP信号转导通路的影响1)静态组:不给予任何力,也不给予任何抑制剂。2)低剪切力对照组:分别给予HUVECs低剪切力（4dyne/cm2）作用5、10分钟、1、5小时,观察在无ERK1/2抑制剂的条件下,低剪切力对ERK1/2磷酸化水平、p65的DNA结合活性及MT1-MMP mRNA表达及其蛋白质活性的影响。分别给予HUVECs低剪切力（4dyne/cm2）作用5、10分钟,同时观察低剪切力对Akt磷酸化水平。3)PD98059组:先给予HUVECs 20μM ERK1/2抑制剂PD98059于孵箱中培养2小时,再给予低剪切力（4dyne/cm2）作用5分钟、1、5小时,观察PD98059对ERK1/2磷酸化的抑制效果及ERK1/2对低剪切力介导p65 DNA结合活性及MT1-MMPmRNA表达及其蛋白质活性的影响。4)LY294002组:先给予HUVECs 50μM Akt抑制剂LY294002于孵箱中培养2小时,再给予低剪切力（4dyne/cm2）作用5分钟、1、5小时,观察LY294002对低剪切力介导及MT1-MMP mRNA表达及其蛋白质活性的影响。4.3黏附斑激酶（FAK）对低剪切力介导的ERK1/2/NF-κB/MT1-MMP信号转导通路的影响1)静态组:不给剪切力,也不给任何抑制剂。2)低剪切力对照组:给予低剪切力（4dyne/cm2）作用3、5、10分钟、1、5小时,在无FAK siRNA的条件下,观察低剪切力对FAK磷酸化水平、p65的DNA结合活性及MT1-MMP mRNA表达及其蛋白质活性的影响。3)FAK siRNA组:先将HUVECs和200pmol FAK siRNA共培养6小时,换液培养48小时后,再给予低剪切力（4dyne/cm2）作用5分钟、1、5小时,观察低剪切力对ERK1/2磷酸化水平、p65的DNA结合活性及MT1-MMP mRNA表达及其蛋白质活性的影响。4.4整合素β1对低剪切力介导的FAK/ERK1/2/NF-κB/MT1-MMP信号转导通路的影响1)静态组:不给剪切力,也不给任何抑制剂。2)低剪切力对照组:给予低剪切力（4dyne/cm2）作用3、5、10分钟、1、5小时,在无整合素β1 siRNA的条件下,观察低剪切力对整合素β1活化水平、FAK磷酸化水平、p65的DNA结合活性及MT1-MMP mRNA表达及其蛋白质活性的影响。3)整合素β1 siRNA组:先将HUVECs和150pmol整合素β1 siRNA共培养6小时,换液培养48小时后,再给予低剪切力（4dyne/cm2）作用5分钟、1、5小时,观察低剪切力对FAK、ERK1/2磷酸化水平、p65的DNA结合活性及MT1-MMPmRNA表达及其蛋白质活性的影响。5.实验方法采用实时定量RT-PCR方法检测MT1-MMP mRNA的表达量;以ELISA法检测细胞MT1-MMP的蛋白质活性;用westernblot方法检测蛋白表达和磷酸化水平;EMSA检测NF-κB p65与DNA的结合活性。6.统计学分析实验结果以均数士标准误表示。应用SPSS13.0软件,采用单因素方差分析对实验结果进行分析,P<0.05为差异具有统计学意义。结果:1.NF-κB调节低剪切力（4dyne/cm2）介导的HUVECs对MT1-MMP mRNA的表达及其蛋白质活性给予HUVECs细胞低剪切力（4dyne/cm2）作用30分钟、1小时和3小时,收集细胞,提取核蛋白,EMSA检测NF-κB p65与DNA的结合活性,结果显示,低剪切力作用后,与静态组比较,p65与DNA的结合活性明显增强（P<0.01）;用抑制NF-κB核转移的细胞渗透肽SN50预培养HUVECs2小时后,给予低剪切力1小时,发现SN50明显抑制了p65与DNA的结合活性（P<0.05）;用SN50预处理细胞2小时,置于流室系统给与低剪切力作用5小时,发现该肽能明显抑制MT1-MMPmRNA和蛋白质的表达同时降低其活性（P<0.01）。2.ERK1/2对低剪切力（4 dyne/cm2）介导的NF-κB/MT1-MMP信号转导通路的影响将HUVECs分别置于流室系统给与低剪切力（4dyne/cm2）作用0、5、10分钟,用Western Blot方法检测ERK1/2的蛋白磷酸化水平,结果显示:ERK1/2的磷酸化在5分钟达到高峰,根据该结果,将HUVECs与ERK1/2的抑制剂PD98059 20μM共培养2小时,再分别给予低剪切力5小时,结果显示,MT1-MMP的mRNA表达及其蛋白质活性水平被明显抑制。将HUVECs用PD98059预处理2小时,再分别给予低剪切力1小时,结果显示,NF-κB的DNA结合活性却明显被抑制。将HUVECs分别置于流室系统给与低剪切力（4dyne/cm2）作用0、10、20分钟,用Western Blot方法检测Akt的蛋白磷酸化水平,结果显示:Akt在低剪切力刺激下其活化程度没有变化;将HUVECs与Akt的抑制剂LY294002 50μM共培养2小时,再分别给予低剪切力5小时,结果显示,MT1-MMP的mRNA表达及其蛋白质活性水平未出现明显变化。3.FAK对低剪切力介导的ERK1/2NF-κB/MT1-MMP信号转导通路的影响将HUVECs分别置于流室系统给与低剪切力（4dyne/cm2）作用0、3、5、10分钟,用Western Blot方法检测FAK的蛋白磷酸化水平,结果显示:FAK的磷酸化在5分钟达到高峰。以FAK siRNA与HUVECs共培养6小时,换液继续培养48小时后,给予低剪切力5小时,实时定量RT-PCR、western blot和ELISA法结果显示,MT1-MMP的mRNA表达和其蛋白质活性水平明显下降（P<0.01）。FAK基因沉默后,再将其置于流室系统给与低剪切力（4dyne/cm2）作用5分钟,提取总蛋白,Western Blot检测发现,5分钟后,ERK1/2的磷酸化水平明显下降。转录因子实验显示,p65的DNA结合活性被明显抑制。4.膜整合素对低剪切力介导的ERK1/2/NF-κB/MT1-MMP信号转导通路的影响将HUVECs给与低剪切力（4dyne/cm2）作用0、3、5、10分钟,用Western Blot方法检测整合素β1的蛋白活化水平,结果显示:整合素β1蛋白在3分钟活化达到高峰。以整合素β1 siRNA与HUVECs共培养2小时6小时,换液继续培养48小时后,给予低剪切力5小时,实时定量RT-PCR和ELISA结果显示,MT1-MMP的mRNA表达和其蛋白质活性水平明显下降（P<0.01）。整合素β1基因沉默后,再将其置于流室系统给与低剪切力（4dyne/cm2）作用5分钟和1小时,提取总蛋白,Western Blot检测发现,低剪切力作用5分钟后,FAK和ERK1/2的磷酸化水平明显下降。提取核蛋白,转录因子实验显示,p65的DNA结合活性被明显抑制。结论:1.低剪切力通过增强NF-κB与DNA结合的活性介导内皮细胞MT1-MMP的高表达。2.低剪切力可以通过ERK1/2活化介导的内皮细胞MT1-MMP的高表达。3.低剪切力作用下,FAK参与了内皮细胞表达MT1-MMP的信号转导过程。4.低剪切力作用下,整合素β1通过FAK-ERK1/2-NF-κB途径参与了内皮细胞MT1-MMP表达的调节。总之,低剪切力通过整合素β1-FAK-ERK1/2-NF-κB信号途径上调内皮细胞MT1-MMP的表达,并增强其活性。背景动脉粥样硬化斑块破裂是促发急性冠脉综合征的主要原因。机械应力及细胞外基质重构在斑块破裂中起主要作用。易于破裂的粥样斑块,其纤维帽中单核细胞密度增加而平滑肌细胞密度减少,而且胶原成分也减少。动脉粥样硬化斑块结构完整性的维持依赖于细胞外基质成分,包括胶原纤维、弹力纤维等。研究认为,斑块肩部基质金属蛋白酶的表达明显增加,因其降解细胞外基质,使纤维帽变薄脆性增加,导致斑块破裂。膜型基质金属蛋白酶1（MT1-MMP,MMP-14）是唯一的锚定于细胞膜上的胶原蛋白酶。已经有研究证实MT1-MMP在动脉粥样硬化斑块的发生和发展过程中有着重要的作用,近来通过动物靶向性性基因敲除发现MT1-MMP在易损斑块的发生发展中可能是中心环节。MT1-MMP在动脉粥样硬化斑块的发生和发展中起着重要的作用。作为一个有潜力的治疗靶点,寻找治疗方法就成了亟待解决的问题。他汀类药物,即3.羟基-3-甲基戊二酸单辅酶A（HMG-CoA）还原酶抑制剂,是临床上广泛使用的调脂药物。近年来,其非调脂作用日益成为研究热点。有研究证实他汀类药物可以抑制MMP-2,9的表达,那么他汀类是否抑制低剪切力介导内皮细胞表达MT1-MMP就成了本研究的主要问题。研究目的:1.明确辛伐他汀是否干预低剪切力介导的内皮细胞表达MT1-MMP;2.探讨辛伐他汀干预低剪切力介导内皮细胞表达MT1-MMP的可能机制。研究方法:1.人脐静脉内皮细胞的原代培养与鉴定根据Jaffe等的方法培养人脐静脉内皮细胞,作方法详见第一部分。2.玻片上内皮细胞的种植将经胰蛋白酶消化后的悬浮内皮细胞种植于用胶原蛋白Ⅰ处理过的载玻片上,利用流体表面张力将其限制在玻片范围。小心移至CO2孵箱,待细胞贴壁后,在置载玻片的培养皿内加入全M199培养液,隔日换液,用于后续实验.3.流室系统由四川大学华西医学中心生物医学工程实验室设计并提供数据,成都西木子公司承接制造。流室测试区满足:（1）层流;（2）二维流动;（3）充分发展的流动。具体结构请参看第一部分。4.细胞剪切力干预分组4.1不同浓度的辛伐他汀对于低剪切力（4 dyne/cm2）介导脐静脉内皮细胞MT1-MMP mRNA表达的影响1)静态对照组:不给予剪切力,细胞在静态下培养。2)低剪切力对照组:给予低剪切力（4 dyne/cm2）作用5小时,以观察MT1-MMP mRNA的变化。3)不同浓度的辛伐他汀组:分别应用1、3、5、10、20μM辛伐他汀处理2小时,给予低剪切力作用5小时,以观察MT1-MMP mRNA的变化。4.2辛伐他汀对低剪切力（4 dyne/cm2）介导脐静脉内皮细胞MT1-MMP蛋白质表达及其活性的影响1)静态对照组:细胞不给予任何剪切力。2)低剪切力对照组:给予低剪切力（4 dyne/cm2）作用5小时,观察低剪切力对MT1-MMP蛋白质表达及其活性的影响。3)辛伐他汀组:将辛伐他汀加入HUVECs培养基中,共培养2小时后,给予低剪切力（4 dyne/cm2）作用5小时,观察低剪切力对MT1-MMP mRNA及蛋白质活性的影响。4.3辛伐他汀对低剪切力（4 dyne/cm2）介导脐静脉内皮细胞MT1-MMPmRNA稳定性的影响1)静态组:不给予任何力,也不给予任何抑制剂。2)低剪切力对照组:分别给予HUVECs低剪切力（4 dyne/cm2）5小时后,在培养基中加入Act D,最终浓度为20μg/ml。然后在不同的时间点（0,1,2,3,5 h）收集细胞,提取总RNA,应用实时定量RT-PCR技术检测MT1-MMP mRNA水平。3)辛伐他汀组:将辛伐他汀加入HUVECs培养基中,共培养2小时后,给予低剪切力（4 dyne/cm2）作用5小时,在培养基中加入Act D,最终浓度为20μg/ml。然后在不同的时间点（0,1,2,3,5 h）收集细胞,提取总RNA,应用实时定量RT-PCR技术检测MT1-MMP mRNA水平。4.4辛伐他汀对参与低剪切力（4 dyne/cm2）介导HUVECs表达MT1-MMP信号转导途径分子的影响1)静态组:不给予任何力,也不给予任何抑制剂。2)低剪切力对照组:分别给予HUVECs低剪切力（4 dyne/cm2）3、5分钟、1小时,观察在无辛伐他汀的条件下,低剪切力对整合素β1活化、FAK和ERK1/2磷酸化水平以及p65的DNA结合活性的影响。3)辛伐他汀组:将辛伐他汀加入HUVECs培养基中,共培养2小时后,分别给予HUVECs低剪切力（4 dyne/cm2）3、5分钟、1小时,观察在存在辛伐他汀的条件下,低剪切力对整合素β1活化、FAK和ERK1/2磷酸化水平以及p65的DNA结合活性的影响。5.实验方法采用探针实时定量RT-PCR方法检测HUVECs MT1-MMP mRNA的表达量;以ELISA法检测细胞培养上清液中MT1-MMP的蛋白质活性;用western blot方法检测蛋白磷酸化水平;EMSA检测NF-κB p65与DNA的结合活性。6.统计学分析实验结果以均数士标准误表示。应用SPSS13.0软件,采用单因素方差分析对实验结果进行分析,p<0.05为差异具有统计学意义。结果:1.辛伐他汀抑制低剪切力（4 dyne/cm2）诱导的脐静脉内皮细胞MT1-MMPmRNA的表达1μmol/L的辛伐他汀即可以使得由低剪切力诱导内皮细胞MT1-MMP的表达受到抑制（P<0.05）,3μmol/L和5μmol/L的辛伐他汀都可以取得相似的效果。10μmol/L的辛伐他汀可以明显抑制内皮细胞MT1-MMP的表达（P<0.01）,而且与静力下内皮细胞表达MT1-MMP没有区别（P>0.05）,20μmol/L的辛伐他汀可以有更好的抑制效果,但是和10μmol/L的辛伐他汀没有明显的区别（P>0.05）。2.辛伐他汀抑制低剪切力（4 dyne/cm2）诱导的脐静脉内皮细胞MT1-MMP的蛋白质表达,同时抑制其活性应用10μmol/L的辛伐他汀与HUVECs共培养2小时后,将HUVECs暴露与低剪切力（4 dyne/cm2）作用5小时,应用western blot检测MT1-MMP蛋白质的表达。辛伐他汀可以抑制由内皮细胞MT1-MMP的表达（P<0.01）。应用ELISA法检测,发现辛伐他汀可以降低内皮细胞表达MT1-MMP的活性（P<0.01）。3.辛伐他汀逆转低剪切力（4 dyne/cm2）对脐静脉内皮细胞MT1-MMP mRNA稳定性的作用应用Act D检验低剪切力（4 dyne/cm2）诱导内皮细胞MT1-MMP mRNA的稳定性,结果显示低剪切力可以诱导MT1-MMP mRNA稳定性增强（P<0.01）。应用10μmol/L的辛伐他汀预处理HUVECs后,将HUVECs暴露与低剪切力（4dyne/cm2）5小时,分析发现由低剪切力导致的MT1-MMP mRNA稳定性下降（P<0.01）。4.辛伐他汀抑制参与低剪切力（4 dyne/cm2）介导HUVECs表达MT1-MMP信号转导分子活化辛伐他汀可以抑制整合素β1活化,同时通过降低FAK、ERK1/2磷酸化水平而抑制其活性（P<0.01）,EMSA结果显示,辛伐他汀可以抑制NF-B与DNA结合的能力（P<0.01）。结论:1.辛伐他汀可以抑制由低剪切力诱导的内皮细胞MT1-MMP表达的上调,同时抑制MT1-MMP蛋白质活性。2.低剪切力可以使MT1-MMP mRNA稳定性增强,辛伐他汀可以逆转这一过程。3.辛伐他汀抑制内皮细胞表达MT1-MMP机制之一是抑制了整合素β1-FAK-ERK1/2-NF-κB信号转导途径。
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