麻疯树（Jatropha curcas）花药培养及两个核糖体失活蛋白基因的表达研究

论文摘要

麻疯树（Jatropha curcas L．）系大戟科麻疯树属植物，具有显著的抗癌活性，在工业用油、生物病虫害防治、新药开发等方面也有着潜在的价值，并且又是干热河谷地区荒山造林的好树种，因此具有广泛的开发利用前景。本实验对麻疯树的花药进行培养，从不同激素和培养方式对花药愈伤组织中PPO和POD活性的影响作了初步研究。克隆麻疯树的核糖体失活蛋白curcin2基因，构建了curcin2基因的两种原核表达载体pET-C和pQE-C，并分别在E．coli Bl21和M15诱导表达，以比较curcin2基因的这两种原核表达系统的差异。在此基础上，进一步研究了curcin2原核表达产物在转化细胞中的存在形式。克隆麻疯树的核糖体失活蛋白curcin，定向克隆到植物双元表达载体pBI121质粒，获得植物表达载体pBI 121-curcin。通过根癌农杆菌和叶盘转化法将curcin基因导入烟草。1．对麻疯树花药愈伤组织诱导条件进行了优化，并对芽分化、根分化进行了初步研究，同时建立细胞悬浮培养体系。结果表明，愈伤组织诱导过程中，单核中晚期最适宜诱导，低温预处理以4℃3～5d为佳，培养基以MS+NAA2.0mg／L+KT0.4mg／L+9％蔗糖较好，最高诱导率为40.24％。芽分化培养基则仅MS+KT2.0mg／L+NAA0.1mg／L+3％蔗糖能分化出芽，诱导率为11.67％。暗培养条件下，1／2MS+IAA0.1mg／L的培养基能诱导愈伤组织生根，但分化率很低，仅6.67％。2．研究了不同激素组合和培养方式对花药愈伤组织中PPO和POD活性的影响。结果表明，固体培养过程中，PPO和POD活性都出现2次活性高峰，一次在3d，一次在21d（添加NAA的出现在24d），分别与逆境和生长旺盛期相关，悬浮培养出现1次，在12d，出现在生长旺盛期；添加2，4-D和NAA的培养基培养的愈伤组织中，PPO和POD的活性要高于添加IBA和IAA的，添加KT的，活性要高于添加6-BA的；光照造成培养方式对PPO活性的影响要大于对POD的影响；在早期PPO和POD的活性都出现高峰，随时间的推移，活性都会下降，PPO的下降趋势远高于POD。3．两个原核表达载体的构建：用根据curcin2基因序列（GenBank登录号：AY435214）设计的扩增成熟肽编码区的特异性引物：P1∶5’-GGATCC（BamHⅠ）ATGGCTGGTTCCACTTT-3’；P2∶5’-GAGCTC（SacⅠ）ATACATTGGAAAGATGAG GA-3’，以提取的麻疯树基因组DNA为模板进行PCR扩增，回收PCR产物并连接到pMD18-T载体，获重组子pMD-18T／curcin2，转化E．coli JM109。经测序以验证目的片段序列的正确性。用BamHⅠ和SacⅠ对重组质粒pMD-18T／curcin和表达载体pET-32（c）、pQE-30进行双酶切，回收目的片段，得到带互补粘性末端的curcin2基因片段（约930 bp）和pET-32（c）、pQE-30的线性表达载体。用T4 DNA连接酶将所得的目的片断分别与线形表达质粒pET-32（c）、pQE-30在16℃下连接，以构建重组表达载体pET-C和pQE-C。并将连接产物转入感受态的E．coli JM109，经菌落PCR、双酶切及测序鉴定，证明目的片段curcin2正确插入表达载体，成功构建原核表达载体pET-C和pQE-C。4．两种重组菌的诱导表达：将含有重组子pET-C、pQE-C的E．coli JM109转化菌于37℃下扩大培养，并提取质粒。把重组质粒pET-C转入感受态的E．coliBL21，重组质粒pQE-C转入感受态的E．coli M15。经菌落PCR、双酶切及测序鉴定，证明成功获得转化子PCB和PCM。用不同的诱导温度，不同的诱导．时间及不同的IPTG诱导浓度同时作用两种重组菌PCB和PCM。经SDS-PAGE和Western-blotting检测，结果表明，在任何诱导条件下，重组子PCB都没有curcin2重组蛋白产生，而PCM都能表达出curcin2的重组蛋白，但主要以包函体形式存在。在本实验设计的诱导条件下，PCM表达curcin2的优化条件为诱导温度16℃，IPTG浓度1mmol·L-1，诱导时间16～24h。在此基础上，进一步研究了curcin2原核表达产物在转化细胞中的存在形式。当诱导温度较低，诱导时间延长时有可溶性的curcin2产生。5．利用PCR技术从麻疯树基因组中分离到编码麻疯树毒蛋白（curcin）的开放阅读框（ORF）。结果表明，curcin基因无内含子存在。该序列定向克隆到植物双元表达载体pBI 121质粒，获得植物表达载体pBI 121-curcin。通过根癌农杆菌和叶盘转化法将curcin基因导入烟草。在含卡那霉素的MS2（MS+6-BA0.1 mg／L+Kan 100 mg／L）培养基上诱导丛生芽，诱导率40％左右。丛生芽在形态上有90％是正常的。正常丛生芽在MS3（MS+Kan 100 mg／L）培养基上诱导生根，生根率达到90％左右。最后将再生苗移栽到土壤中培养，成活率达95％。再生苗经过PCR检测证明15株中有13株整合了curcin基因。经过RT-PCR检测，有10株在转录水平上得到表达。转基因烟草对力枯丝核菌（Rhizoctonia solani）有一定程度的抗性。

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• 英文摘要
• 第一章 麻疯树花药培养及愈伤组织中 PPO、POD活性研究
• 1. 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 1.2.1 麻疯树花药愈伤组织诱导
• 1.2.2 花药愈伤组织芽分化
• 1.2.3 花药愈伤组织根分化
• 1.2.4 悬浮培养体系的建立
• 1.2.5 培养条件对愈伤组织中PPO和POD活性的影响
• 2. 结果与分析
• 2.1 麻疯树花药愈伤组织诱导
• 2.1.1 花药愈伤组织的诱导
• 2.1.2 不同发育时期对愈伤组织诱导的影响
• 2.1.3 低温预处理对愈伤组织诱导的影响
• 2.1.4 激素组合对愈伤组织诱导的影响
• 2.1.5 蔗糖浓度对愈伤组织诱导的影响
• 2.2 花药愈伤组织芽分化
• 2.3 花药愈伤组织根分化
• 2.4 悬浮培养体系的建立
• 2.5 培养条件对愈伤组织中PPO和 POD活性的影响
• 3. 讨论
• 3.1 花药培养几种重要的影响因素
• 3.1.1 花粉的发育时期
• 3.1.2 低温预处理
• 3.1.3 激素组合与浓度
• 3.1.4 蔗糖浓度
• 3.2 花药培养中的褐化现象
• 3.2.1 造成褐化的原因
• 3.2.2 防止褐化的措施
• 3.3 悬浮培养体系的建立
• 3.4 培养条件对愈伤组织中PPO活性的影响
• 3.5 培养条件对愈伤组织中POD活性的影响
• 参考文献
• 第二章 麻疯树核糖体失活蛋白基因curcin2的两个原核表达载体的构建
• 1 材料和方法
• 1.1 实验材料
• 1.1.1 材料、菌株及质粒载体
• 1.1.2 试剂、试剂盒、酶
• 1.1.3 培养基
• 1.2 实验方法
• 1.2.1 引物设计
• 1.2.2 麻疯树基因组 DNA的提取
• 1.2.3 curcin2基因成熟肽编码区的获得
• 1.2.3.1 PCR扩增
• 1.2.3.2 回收 PCR产物
• 1.2.3.3 连接
• 1.2.3.4 转化
• 1.2.3.5 菌落PCR及测序鉴定
• 1.2.4 原核表达载体pET-C和pQE-C的构建
• 1.2.4.1 目的片段的双酶切
• 1.2.4.2 载体的双酶切
• 1.2.4.3 表达片断的连接、转化
• 1.2.5 重组质粒的检验
• 1.2.5.1 菌落PCR检测
• 1.2.5.2 重组质粒的双酶切检测
• 1.2.5.3 测序检测
• 2 结果与分析
• 2.1 DNA的提取
• 2.2 目的片段的PCR扩增
• 2.3 原核表达载体pET-C和pQE-C的构建
• 2.4 重组子的鉴定
• 2.4.1 菌落PCR鉴定
• 2.4.2 双酶切鉴定
• 2.4.3 测序鉴定
• 3 讨论
• 参考文献
• 第三章 麻疯树核糖体失活蛋白基因 curcin2的原核表达研究
• 1. 材料和方法
• 1.1 实验材料
• 1.1.1 菌株
• 1.1.2 试剂、试剂盒、酶
• 1.2 方法
• 1.2.1 转化
• 1.2.2 转化子的鉴定
• 1.2.2.1 菌落PCR检测
• 1.2.2.2 重组质粒的双酶切检测
• 1.2.2.3 测序检测
• 1.2.3 重组质粒pET-C和pQE-C的诱导表达
• 1.2.3.1 不同温度下的诱导表达
• 1.2.3.2 不同时间下的诱导表达
• 1.2.3.3 不同IPTG浓度的诱导表达
• 1.2.4 curcin2表达形式和溶解性的分析
• 1.2.4.1 SDS-PAGE检测
• 1.2.4.2 Western-blotting检测
• 2 结果与分析
• 2.1 转化子的鉴定
• 2.1.1 菌落 PCR鉴定
• 2.1.2 双酶切鉴定
• 2.1.3 测序鉴定
• 2.2 curcin2在两个原核表达系统中的诱导表达
• 2.2.1 curcin2的两个原核表达系统比较
• 2.2.2 PCM诱导表达条件的优化
• 2.2.2.1 表达温度的优化
• 2.2.2.2 表达时间的优化
• 2.2.2.3 IPTG浓度的优化
• 2.2.3 Western-blottiong检测
• 3 讨论
• 参考文献
• 第四章 麻疯树核糖体失活蛋白基因 curcin的真核表达研究
• 1. 材料和方法
• 1.1 实验材料
• 1.1.1 植物材料
• 1.1.2 菌种
• 1.1.3 载体
• 1.1.4 试剂（盒）和酶
• 1.1.5 培养基
• 1.2 实验方法
• 1.2.1 麻疯树基因组 DNA的提取
• 1.2.2 大肠杆菌感受态细胞的制备
• 1.2.3 农杆菌感受态细胞的制备
• 1.2.4 curcin ORF的扩增
• 1.2.5 表达载体构建
• 1.2.6 农杆菌对烟草叶片的感染
• 1.2.7 再生烟草苗的获得及形态观察
• 1.2.8 诱导生根
• 1.2.9 转基因植株的检测
• 1.2.10 再生植株的移栽
• 1.2.11 转基因植株的抗病性测定
• 2 结果与分析
• 2.1 curcin基因的扩增
• 2.2 表达载体的构建
• 2.3 Kan抗性植株的分化与形态观察
• 2.4 转基因植株的鉴定
• 2.5 转基因植株的移栽
• 2.6 转基因植株抗病性分析
• 3 讨论
• 参考文献
• 文献综述: 植物花药培养及麻疯树核糖体失活蛋白的研究进展
• 第五章 植物花药培养研究进展（文献综述）
• 1. 植物花药培养概述
• 1.1 花药培养的意义
• 1.2 植物花药培养的意义
• 1.2.1 大大加快植物杂交育种进程
• 1.2.2 高效创建植物新的种质
• 1.2.3 研究植物重要性状的遗传变异规律
• 1.3 植物花药培养程序
• 1.3.1 植物花药的采集
• 1.3.2 预处理
• 1.3.3 消毒方法
• 1.3.4 培养方法
• 1.3.5 植株再生
• 1.3.6 练苗和移栽
• 1.3.7 花粉植株的染色体加倍
• 1.4 植物花药培养的影响因素
• 1.4.1 供体的基因型
• 1.4.2 供体的生理状况
• 1.4.3 花粉发育的时期
• 1.4.4 预处理
• 1.4.5 培养基
• 1.4.6 培养条件
• 2. 植物花药培养目前存在的问题
• 第六章 麻疯树核糖体失活蛋白的研究进展（文献综述）
• 1. 研究史的回顾
• 2. 核糖体失活蛋白的分类
• 3. 核糖体失活蛋白的分布
• 4. 植物核糖体失活蛋白的生物化学性质
• 5. 核糖体失活蛋白的毒性
• 6. 核糖体失活蛋白的作用机制
• 7. 核糖体失活蛋白的酶学活性
• 7.1 RNA N-糖苷酶活性
• 7.2 RNA 水解酶活性
• 7.3 多核苷酸:腺苷糖苷酶活性
• 7.4 对超螺旋环状 DNA的酶活性
• 8. 核糖体失活蛋白的生物学活性
• 8.1 核糖体失活蛋白的抗肿瘤作用
• 8.2 核糖体失活蛋白的抗病毒活性
• 8.2.1 核糖体失活蛋白对植物病毒的作用
• 8.2.2 核糖体失活蛋白对人免疫缺陷病毒的作用
• 8.3 核糖体失活蛋白对昆虫的作用
• 8.4 核糖体失活蛋白对真菌的作用
• 8.5 核糖体失活蛋白调节细胞代谢
• 9. 核糖体失活蛋白的应用
• 9.1 核糖体失活蛋白在农业上的应用
• 9.2 核糖体失活蛋白在医学上的应用
• 10. 总结与展望
• 参考文献
• 致谢
• 在读期间发表论文情况