伪狂犬病毒IE180和EP0基因的表达调控

论文摘要

伪狂犬病毒（Pesudorabies virus,PRV）是疱疹病毒科α疱疹病毒亚科的一员,能够引起多种家畜和野生动物的伪狂犬病,猪为该病毒的贮存宿主。伪狂犬病在猪群中的爆发和流行给全世界的养猪业造成了巨大的经济损失,虽然个别国家在该病的根除上已经取得了一定的成效,但在许多其它国家和地区仍然呈地方性流行,所以在养猪业上伪狂犬病仍然是疾病控制的一个重点。PRV和所有的其它疱疹病毒一样,基因组的表达呈级联方式调节,生命周期中都经历一个潜伏感染时期。许多疱疹病毒都编码几个立即早期基因和更多的早期基因,然而PRV只有一个立即早期基因IE180,已经报道的早期基因只有EP0、TK和UL54三个。另外,虽然PRV的宿主谱很广,而且和人的一些疱疹病毒同源性很高,但是对人类并不敏感,所以它逐渐被病毒学家们用做一个研究疱疹病毒分子生物学的模式生物。本研究通过对PRV的立即早期基因IE180和早期基因EP0的调控功能的研究,验证了IE180基因对EP0基因和TK基因的正调控作用;研究了IE180基因和EP0基因的自调控;发现了PRV Ea株和Fa株的EP0基因（EP0/Ea、EP0/Fa）对IE180基因和TK基因的负调控作用;探讨了EP0中特定氨基酸的改变对其调控功能的影响;初步把EP0的负调控必需功能域定位在环指结构域部位。具体研究内容如下:1.PRV Ea株IE180、EP0和TK三个基因启动子的克隆及活性验证通过PCR扩增的方法从PRV Ea株基因组DNA中克隆了IE180、EP0和TK三个基因的启动子序列,并进行了序列测定。用这些启动子序列分别置换本研究中所构建的两个报告基因质粒（pcDNA-EGFP,pcDNA-lacZ）的CMV启动子,以验证启动子活性。瞬时转染实验证明所克隆的三个基因的启动子序列均具有启动子活性,可以在没有病毒任何其它基因表达的情况下启动报告基因的转录。2.IE180基因对EP0、TK基因的转录激活IE180基因增强TK基因的表达已经得到了证实,但是对EP0基因的调控尚无报道。本研究通过IE180基因的真核表达质粒与EP0或TK基因启动子的报告基因质粒共转染细胞,发现IE180基因的表达确实能够显著增强EP0基因和TK基因启动子的转录,符合预期结果。3.IE180基因和EP0基因的自调控以前的研究证实PRV Ka株IE180基因在转染细胞中的表达能够抑制自身启动子的活性,表现出一种负的自调控机制。本研究在用PRV Ea株IE180基因启动子的报告基因质粒和IE180基因真核表达质粒共转染细胞时,发现Ea株的IE180基因也同样具有负的自调控现象。另外本研究发现PRV Ea株的早期基因EP0在转染细胞中也显著抑制了其自身启动子的活性,表现出对自身的负调控现象,之前对PRV的研究中尚没有类似的报道。4.PRV Fa株EP0基因的克隆及序列分析通过PCR扩增的方法从PRV Fa株基因组DNA中克隆了完整的EP0基因,并进行了序列测定。将推导出的的PRV Fa株EP0氨基酸序列与Ea株的EP0序列进行比较,发现它们均编码409个氨基酸。相对于日本分离株YS-81株的EP0（EP0/YS-81）而言,它们都在相同的位置缺失了一个氨基酸,而且存在6个相同的氨基酸突变,但是EP0/Ea比EP0/Fa又多出了3个氨基酸的突变。5.EP0/Ea和EP0/Fa对IE180、TK基因的负调控实验初期,在用PRV Ea株EP0基因的真核表达质粒分别与IE180和TK基因启动子的报告基因质粒共转染细胞时,发现Ea株EP0的表达能够显著抑制IE180和TK基因的启动子的活性,表现为一种负调控。为了验证PRV Fa株的EP0是否也具有同样的功能,克隆了PRV Fa株EP0的全基因序列。随后的共转染实验证明,PRVFa株的EP0基因的表达同样显著抑制了IE180和TK基因启动子的活性。6.EP0/Ea、EP0/Fa的紧接环指结构域的两个氨基酸的变化对其调控功能的影响根据对不同毒株EP0的氨基酸序列分析和疏水性分析,推测紧接环指结构域的两个氨基酸的变化可能会较大的影响EP0的调控功能。为了证实这个推测,采用DNA合成置换的方法对EP0/Ea和EP0/Fa基因中的第85、86位氨基酸进行回复突变。进一步的实验表明,当对EP0/Fa进行回复突变后,其对IE180和TK启动子的抑制功能明显减弱;而在EP0/Ea中,这两个氨基酸的改变对其抑制效应并没有产生显著的变化。这些结果说明,EP0中第85、86位氨基酸的改变确实能够影响整个EP0的调控功能。7.PRV Ea株和Fa株EP0基因的功能域定位采用PCR扩增的方法构建了EP0/Ea、EP0/Fa的不同区段的缺失突变体,进一步构建对应的真核表达质粒。将这些突变体的真核表达质粒分别与IE180和TK基因启动子的报告基因质粒共转染细胞,做流式分析。分析结果发现,在EP0/Ea和EP0/Fa中环指结构域的存在和完整对其发挥负调控功能来说是必需的,另外氨基酸第1-113的突变体表现出显性隐性的特性。8.PRV IE180基因特异性siRNA分子的筛选先后根据已知的PRV TNL株和在本研究中测出的Ea株IE180基因序列设计合成了5个siRNA分子,构建相应的表达质粒,与IE180-EGFP融合蛋白真核表达质粒共转染细胞进行筛选,结果发现所设计的5个siRNA分子均无显著的抑制效果。推测可能是由于目标序列结构的复杂性等所造成,靶位点可能被目标RNA的二级结构或者高度折叠区域掩盖从而阻止了siRNA的结合。另外由于IE180基因测序难度大,测出序列可能不准确从而影响了siRNA的效果。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 文献综述
• 1.1 伪狂犬病的流行病学
• 1.2 伪狂犬病毒（PRV）的分子生物学
• 1.2.1 病毒粒子结构
• 1.2.2 病毒基因组
• 1.2.3 病毒主要蛋白
• 1.2.4 病毒的复制周期
• 1.2.5 立即早期基因IE180
• 1.2.6 早期基因EP0
• 1.2.7 TK基因和UL54基因
• 1.3 伪狂犬病毒的神经嗜性和潜伏感染
• 1.3.1 伪狂犬病毒的神经嗜性
• 1.3.2 伪狂犬病毒的潜伏感染
• 1.4 RNAi技术
• 2 研究目的与意义
• 3 材料与方法
• 3.1 实验材料
• 3.1.1 毒株、细胞、实验动物和多克隆抗体
• 3.1.2 菌种与质粒
• 3.1.3 工具酶及相关试剂
• 3.1.4 主要培养基及其配制
• 3.1.5 主要缓冲液及其配制
• 3.1.6 主要仪器设备
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 细胞培养和病毒增殖
• 3.2.2 细胞转染实验
• 3.2.3 PRV基因组模板的制备
• 3.2.4 DNA片段的回收与纯化
• 3.2.5 大肠杆菌感受态细胞的制备与转化（氯化钙法）
• 3.2.6 连接产物或质粒的转化
• 3.2.7 质粒的小量制备（碱裂解法）
• 3.2.8 质粒的大量制备（碱裂解法）
• 3.2.9 蛋白质诱导表达
• 3.2.10 SDS-PAGE电泳
• 3.2.11 重组蛋白的纯化
• 3.2.12 抗体的制备
• 3.2.13 Western blot检测
• 3.2.14 流式细胞仪分析
• 3.2.15 β-半乳糖苷酶在真核细胞表达的检测
• 4 结果与分析
• 4.1 IE180基因特异性siRNA分子的设计、合成及筛选
• 4.1.1 IE180与EGFP基因融合表达载体的构建
• 4.1.2 IE180基因的分段克隆、表达及抗体制备
• 4.1.3 IE180基因的部分序列测定
• 4.1.4 siRNA分子的设计与合成
• 4.1.5 siRNA分子表达载体的构建及测序验证
• 4.1.6 细胞共转染及siRNA分子的筛选
• 4.2 报告基因真核表达载体的构建
• 4.2.1 EGFP报告基因载体的构建
• 4.2.2 lacZ报告基因载体的构建
• 4.3 PRV Ea株IE180基因启动子的克隆与功能验证
• 4.3.1 PRV Ea株IE180基因启动子的克隆与序列测定
• 4.3.2 IE180基因启动子的功能验证
• 4.4 PRV Ea株EP0基因启动子的克隆与功能验证
• 4.4.1 PRV Ea株EP0基因启动子克隆与序列测定
• 4.4.2 EP0基因启动子的功能验证
• 4.5 PRV Ea株TK基因启动子的克隆与功能验证
• 4.5.1 PRV Ea株TK基因启动子克隆与序列测定
• 4.5.2 TK基因启动子的功能验证
• 4.6 PRV Ea株和Fa株EP0基因及其突变体的真核表达载体的构建
• 4.6.1 PRV Fa株EP0基因的克隆与序列分析
• 4.6.2 真核表达载体pcEP0/Ea、pcEP0/Fa的构建
• 4.6.3 EP0基因同源性比较
• 4.6.4 不同毒株EP0疏水性比较分析
• 4.6.5 真核表达载体pcEP0mut/Ea、pcEP0mut/Fa的构建
• 4.6.6 Western-blot检测EP0/Ea、EP0/Fa、mutEP0/Ea与mutEP0/Fa在细胞中的表达
• 4.7 PRV Ea株IE180、EP0和Fa株EP0对IE180、EP0和TK基因启动子的调控分析
• 4.7.1 IE180基因真核表达载体的构建
• 4.7.2 PRV Ea株IE180、EP0、TK基因启动子活性比较
• 4.7.3 IE180/Ea、EP0/Ea和EP0/Fa对IE180、EP0和TK基因启动子的调控分析
• 4.8 EP0/Ea、mutEP0/Ea、EP0/Fa及mutEP0/Fa对PRV Ea株IE180基因启动子的调控分析
• 4.8.1 pIE-EGFP与EP0不同表达载体的共转染及流式细胞仪分析
• 4.8.2 pIE-LacZ与EP0表达载体的共转染及β-gal表达检测
• 4.9 EP0/Ea、mutEP0/Ea、EP0/Fa及mutEP0/Fa对PRV Ea株TK基因启动子的调控分析
• 4.9.1 pTK-EGFP与EP0表达载体的共转染及流式细胞仪分析
• 4.9.2 pTK-LacZ与EP0表达载体的共转染及β-gal表达检测
• 4.10 PRV Ea株和Fa株EP0基因的功能域分析
• 4.10.1 不同截短形式的EP0/Ea缺失突变体的真核表达载体的构建
• 4.10.2 不同截短形式的EP0/Fa缺失突变体的真核表达载体的构建
• 4.10.3 pIE-EGFP和pTK-EGFP与EP0/Ea不同缺失突变体真核表达质粒的共转染及流式细胞仪分析
• 4.10.4 pIE-EGFP和pTK-EGFP与EP0/Fa不同缺失突变体真核表达质粒的共转染及流式细胞仪分析
• 5 讨论与结论
• 5.1 讨论
• 5.1.1 PRV Ea株IE180、EP0、TK三个基因启动子的克隆
• 5.1.2 IE180基因对EP0和TK基因的转录激活
• 5.1.3 IE180基因和EP0基因的自调控
• 5.1.4 EP0/Ea和EP0/Fa对IE180、TK基因的负调控
• 5.1.5 PRV不同毒株EP0的比较分析
• 5.1.6 EP0/Ea、EP0/Fa的第85和第86位氨基酸的变化对其调控功能的影响
• 5.1.7 PRV Ea株和Fa株EP0基因的功能域分析
• 5.1.8 PRV IE180基因特异性siRNA分子的筛选
• 5.2 结论
• 参考文献
• 致谢
• 附录