不同去核方法和融合、激活条件对小鼠体细胞核移植效果的影响

论文摘要

本研究对小鼠体细胞核移植流程中不同去核方法和融合、激活条件对核移植的效果进行了比较,进一步优化了这些关键步骤的操作条件,为小鼠体细胞核移植的研究及该技术的应用打下了基础。 1.研究了两种不同持卵方法及不同口径的去核针对小鼠卵母细胞去核后存活率的影响,并对两种不同小鼠品系卵母细胞去核后的存活率作了比较。结果表明,用改进的持卵方法能有效减小去核对卵母细胞的机械损伤,使卵母细胞去核后的存活率达82.13%,与传统持卵方法（23.60%）相比有显著提高（P<0.01）。使用口径14～16μm的去核针,小鼠卵母细胞去核后存活率（80.87%）显著（P<0.05）高于10～12μm（63.13%）和20μm（53.26%）两组去核针。C57BL/6（♂）×DBA（♀）（B6D2F1）品系的卵母细胞去核存活率（82.13%）显著（P<0.01）高于ICR品系（49.77%）。 2.将小鼠体细胞注入去核卵母细胞透明带下,采用电融合的方法制备体细胞核移植重构卵。结果表明,去移核卵在甘露醇浓度为0.32mol/L的融合液中的融合率（52.28%）显著（P<0.05）高于甘露醇浓度为0.28mol/L和0.36mol/L两组的融合率（22.42%和21.84%）。尾尖细胞与去核卵母细胞在电压800V/cm,10μs,一次电击的融合率为63.15%;胎儿成纤维细胞在1000V/cm,10μs,一次电击作用下与去核卵母细胞的融合率为67.68%,显著（P<0.05）高于其它融合条件组。胎儿成纤维细胞的融合率,随着传代次数的增加而下降,原代和传代一次细胞的融合率为59.20%和57.28%,与传代5次时供核细胞的融合率（38.79%）差异显著（P<0.05）。 3.研究了SrCl2浓度和处理时间以及卵龄对小鼠卵母细胞活化的影响。研究表明,以含4mmol/L SrCl2和5μg/mLCB的无钙CZBG液对小鼠卵母细胞活化效果最好（86.61%）,显著（P<0.05）优于SrCl2浓度为2.0、6.0、8.0、10.0mmol/L的激活操作液。SrCl2作用时间180min（85.96%）显著（P<0.05）好于60min、120min、210min。注射hCG后18h、20h卵母细胞的活化率（82.07%和85.44%）显著高于（P<0.05）14、16h的活化率（5.10%和15.15%）。 4.小鼠体细胞核移植重构胚的着床前发育情况。将389枚融合重构胚在含4mmol/L SrCl2的无钙和5μg/mlCBCZBG液中培养3h,激活率为53.49%。体内培养共80枚重构胚,72h后子宫回收胚胎,其中,尾尖细胞供核组的2-细胞发育率为41.68%（5/12）,桑葚胚发育率为0%（0/12）;胎儿成纤维细胞供核组的2-细胞发育率为27.94%（19/68）,桑葚胚发育率为5.88%（4/68）。

论文目录

• 前言
• 文献综述 哺乳动物细胞核移植技术及研究进展
• 1 细胞核移植的研究进展
• 2 哺乳动物体细胞核移植的技术程序
• 3 细胞核移植的理论基础及相关机理
• 4 影响核移植效率的因素
• 5 细胞核移植技术的应用前景
• 实验一 小鼠卵母细胞去核方法的研究
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 实验二 不同融合条件对小鼠体细胞核移植重构卵融合率的影响
• 1 材料和方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 实验三 应用氯化锶对小鼠卵母细胞孤雌活化的研究
• 1 材料和方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 实验四 小鼠体细胞核移植重构胚的着床前发育
• 1 材料和方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 研究生期间发表论文