陕西省PRRSV流行株的分离鉴定及其致病性的研究

论文摘要

从2006年5月份开始,我国华南地区的不少猪场,暴发了一种急性、热性,高致病性和致死性的“猪高热病”。该病危害严重,具传播区域广、传播速度快、发病率高、死亡率高、治愈率低等特点,造成猪只大量死亡,并逐渐扩散和蔓延到我国的大部分地区,给养猪业带来巨大的经济损失。猪高热病的病因特别是病原已成为兽医学术界、养猪界关注的焦点,许多科研机构、院校的专家为此做了大量的工作,现已明确疫情主要是由高致病性猪蓝耳病引起的。为了研究猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）在“猪高热病”中的地位,及陕西“高热病”猪群中流行的PRRSV的分子流行病学与致病性情况,本研究对陕西省持续高热病猪体内的PRRSV流行株进行了分离、鉴定和基因克隆;分析了PRRSV流行株之间及其与国内外已发表的其它毒株间的遗传变异关系;并将所分离的PRRSV流行株与JXA-1分离毒株对健康猪进行攻毒试验,以探索陕西分离毒株与JXA-1分离毒株的致病性的差异,同时也为“猪高热病”的防治奠定理论基础。本研究的主要内容和结果如下:1.将采自陕西省西安、渭南、宝鸡、榆林、汉中等地区的不同猪场持续发热的发病猪的血清、肺脏、脾和淋巴结等共计146份样品,通过RT-PCR和PCR进行PRRSV、CSFV、PCV、PRV的病原学检测。结果表明:被检样品中PRRSV的阳性率达46.6%（68/146）;PRRSV与CSFV、PCV2和PRV 3种病毒均有混合感染现象, PRRSV + CSFV混合感染率为25%（17/68）,PRRSV +PCV2为19.1%（13/68）,PRRSV + PRV为4.4% （3/68）,PRRSV + PCV2+ CSFV为14.7%（10/68）, PRRSV + PCV2+ CSFV+PRV为2.9%（2/68）。说明以PRRSV为主要病原的混合感染在所检测的高热病发病猪群的存在是非常普遍的。2.将处理好的病料接种于长成单层的Marc-145细胞分离病毒,接种3 d后出现明显的细胞病变,并通过RT-PCR和间接免疫荧光试验对病毒进行了鉴定,结果表明从华县猪场和西安野生动物园的野猪的病料中分离到两株PRRSV,命名为Shannxi-1,Shannxi-2。3.利用分离毒株的第五代细胞毒,采用RT-PCR方法,分段设计引物,成功扩增出PRRSV Shannxi-1,Shannxi-2的NSP2、ORF27等基因片段,分别将其克隆到pMD18-T载体中,对鉴定为阳性的重组质粒进行测序。序列比较的结果显示Shannxi-1,Shannxi-2毒株与国内外各美洲型分离株全序列同源性在88.8%～99.3%,而与欧洲型分离株LV株的差异较大,同源性为50.5%。表明Shannxi-1,Shannxi-2为美洲型毒株。Shannxi-1,Shannxi-2毒株与经典的美洲型毒株相比,存在许多处碱基的置换、错位和缺失,其中非结构蛋白NSP2的序列中存在30个氨基酸的不连续缺失。依据NSP2与ORF5序列对国内外分离株进行了系统进化分析,表明依据NSP2序列美洲型分离株可划分为2个亚群;依据ORF5序列可初步划分为2个亚群,我国大陆分离株分属于其中的2个亚群,即Shannxi-1,Shannxi-2与JXA1、Henan-1、HuN4、HUB2、CH-la等毒株的遗传距离较近,属于一个亚群;BJ-4属于另一个亚群。4.通过Reed-Muench法测得JXA-1、Shannxi-1,Shannxi-2 3株PRRSV NSP2缺失株（第4代）的病毒滴度分别为10-4.8 TCID50/0.1mL、10-4.8TCID50/0.1mL、10-5.2TCID50/0.1mL。然后将毒株分别肌肉接种PRRSV和PCV2抗原抗体均为阴性的健康猪,并设空白对照组猪。结果表明:攻毒组猪均表现出典型的猪繁殖与呼吸综合征临床症状,攻毒后可从血清和棉签拭子中检测到PRRSV抗原,且Shannxi-2的感染性较其他两株病毒强,但未见猪病死。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 文献综述
• 第一章 猪繁殖与呼吸综合征及其病原的研究进展
• 1.1 猪繁殖与呼吸综合征病毒生物学特性
• 1.1.1 病毒的形态特征
• 1.1.2 病毒的侵入和释放
• 1.1.3 病毒的培养特性
• 1.1.4 病毒的抵抗力
• 1.1.5 病毒的血凝特性
• 1.2 猪繁殖与呼吸综合征病毒分子生物学研究
• 1.2.1 病毒的基因组结构与特点
• 1.2.2 PRRSV 的分子遗传变异
• 1.2.2.1 ORF 1 的遗传变异
• 1.2.2.2 结构蛋白编码区的遗传变异
• 1.3 PRRSV 的流行病学研究
• 1.4 PRRS 的临床症状
• 1.5 诊断研究
• 1.5.1 病毒分离
• 1.5.2 抗原检测
• 1.5.3 血清学试验检测抗体
• 1.5.3.1 免疫过氧化物酶细胞单层试验（IPMA）
• 1.5.3.2 荧光抗体试验（IFA）
• 1.5.3.3 血清中和试验（SN）
• 1.5.3.4 酶联免疫吸附试验（ELISA）
• 1.5.4 分子生物学检测方法
• 1.5.4.1 原位杂交技术（ISH）
• 1.5.4.2 RT-PCR 技术
• 1.6 免疫学研究
• 1.6.1 感染免疫反应
• 1.6.2 对免疫细胞的影响
• 1.6.3 体液免疫
• 1.6.4 细胞免疫
• 1.6.5 细胞因子的产生
• 1.6.6 抗体依赖性增强作用
• 1.7 PRRSV 与其他病原体的相互作用
• 1.8 疫苗免疫
• 试验研究
• 第二章 陕西省PRRSV 与CSFV、PCV2、PRV 混合感染的检测
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 主要试验仪器
• 2.1.2 主要试剂和耗材
• 2.2 试验方法
• 2.2.1 病例与猪群的调查
• 2.2.2 病料的采集及处理
• 2.2.3 引物合成
• 2.2.4 PRRSV 和CSFV 的RT-PCR 检测
• 2.2.5 PCV2 和PRV 的PCR 检测
• 2.3 结果
• 2.3.1 猪病料中PRRSV、CSFV、PCV2 和PRV 的检测结果
• 2.4 讨论
• 2.5 小结
• 第三章 陕西省PRRSV 流行毒株的分离与初步鉴定
• 3.1 实验材料
• 3.1.1 主要试验仪器
• 3.1.2 主要试剂
• 3.1.3 细胞与单克隆抗体
• 3.2 试验方法
• 3.2.1 培养基的配制
• 3.2.2 细胞培养用试剂的配制
• 3.2.3 引物设计
• 3.2.4 细胞培养
• 3.2.5 病毒分离
• 3.2.6 间接免疫荧光检测
• 3.3 结果
• 3.4 讨论
• 3.5 小结
• 第四章 陕西省PRRSV 流行毒株主要基因片段的序列分析
• 4.1 实验材料
• 4.1.1 毒株
• 4.1.2 菌株、质粒
• 4.1.3 主要仪器
• 4.1.4 主要试剂及培养基的配制
• 4.1.5 PRRSV 分离株核苷酸序列
• 4.1.6 分子生物学分析软件
• 4.2 实验方法
• 4.2.1 PRRSV 病毒的增殖
• 4.2.2 引物设计
• 4.2.3 PRRSV 感染的MARC-145 细胞中病毒总RNA 的提取
• 4.2.4 各段基因的扩增
• 4.2.5 RT-PCR 产物的鉴定
• 4.2.6 PCR 产物的纯化回收cDNA 片段
• 4.2.7 纯化产物与pMD-18T Vector 连接
• 2 法）'>4.2.8 感受态细胞的制备（CaCl₂法）
• 4.2.9 连接产物的转化
• 4.2.10 重组质粒的提取
• 4.2.11 重组质粒的PCR 鉴定
• 4.2.12 重组质粒的酶切鉴定
• 4.2.13 重组质粒的测序分析
• 4.2.14 本研究分离毒株基因序列变异分析
• 4.3 实验结果
• 4.3.1 PRRSV 各个基因片段的RT-PCR 扩增结果
• 4.3.2 重组质粒的PCR 鉴定结果
• 4.3.3 重组质粒的酶切鉴定结果
• 4.3.4 各个基因片段的测序与序列拼接
• 4.3.5 NSP2 的氨基酸序列分析
• 4.3.6 各结构蛋白核苷酸序列及其推导氨基酸序列相似性比较
• 4.3.7 系统进化分析
• 4.4 讨论
• 4.4.1 关于PRRSV 的变异
• 4.4.2 NSP2 区段的变异
• 4.4.3 结构蛋白编码区的变异
• 4.4.4 PRRSV 的系统进化分析
• 4.5 小结
• 第五章 猪繁殖与呼吸综合征病毒变异株的致病性研究
• 5.1 试验材料
• 5.1.1 毒株
• 5.1.2 试剂
• 5.1.3 试验动物
• 5.2 试验方法
• 5.2.1 病毒增殖
• 5.2.2 病毒TCID50 的测定
• 5.2.3 致病性试验
• 5.2.3.1 血清中PRRSV 抗体的检测
• 5.2.3.2 中和试验
• 5.3 结果
• 5.3.1 病毒的增殖
• 5.3.2 TCID50 测定
• 5.3.3 致病性试验
• 5.3.3.1 体温变化
• 5.3.3.2 临床症状
• 5.3.3.3 抗原和抗体检测结果
• 5.4 讨论
• 5.5 小结
• 结论
• 参考文献
• 英文缩略词及中英文对照
• 致谢
• 作者简介