远红色双分子荧光互补系统的建立和应用

论文摘要

蛋白质-蛋白质相互作用（protein-protein interaction,PPI）几乎调控一切生命活动,比如生长、发育和凋亡。近年来发展的双分子荧光互补（bimolecular fluorescencecomplementation,BiFC）分析技术是活细胞内研究蛋白质-蛋白质相互作用及其定位的新技术。与荧光共振能量转移（fluorescence resonance energy transfer,FRET）相比,BiFC技术具有检测灵敏度更高、更直接和易于操作等特点。文献已报道的10种能够发生荧光互补的荧光蛋白中,只有GFP的三个突变体Cerulean（CFP突变体）、Citrine和Venus（YFP突变体）在生理温度（37℃）下可以进行荧光互补。目前,已报道可进行荧光互补的红色荧光蛋白只有mRFP1-Q66T和mCherry,且对温度敏感,只能在相对低温（≤30℃）下发生荧光互补。寻找可在37℃下发生荧光互补的红色荧光蛋白,将有利于活细胞内多对蛋白质相互作用的同时检测。本研究对最新的远红色荧光蛋白mKate进行荧光互补实验,发现mKate能够在37℃培养的活细胞中进行荧光互补。根据与mKate高相似度的eqFP611的晶体结构,突变筛选获得亮度更好的mKate-S158A（命名为mLumin）,同样也证明了其37℃下的荧光互补能力。利用基于mLumin的BiFC系统对肿瘤和神经疾病相关的蛋白质间相互作用进行了研究,主要研究结果如下:1)对已报道的mRFP1-Q66T和mCherry以及候选蛋白TagRFP和mKate分别进行37℃和26℃下的荧光互补实验。结果显示,mKate可以在37℃下发生荧光互补,而亮度最亮的TagRFP却只能在26℃下进行荧光互补。比较不同红色荧光蛋白的BiFC位点发现,mKate的151位点或其它蛋白相对应位点的BiFC效率最高。2) mKate进行定点饱和突变（S158X）,筛选得到亮度分别增加1倍和0.3倍的mLumin（mKate-S158A）和mKate-S158C。体外生化和光谱分析表明:mLumin和mKate-S158C仍然为单体,且荧光光谱和成熟时间与mKate基本一致;突变体耐酸性增强;mLumin和mKate-S158C的光稳定性分别为mKate的0.3和1.5倍。3)在活细胞内证实了EGFR信号通路中STAT5B的预二聚化以及与EGFR的相互作用。结合使用基于mCerulean、mVenus和mLumin的BiFC系统,对EGFR信号通路中的三对具有不同亚细胞定位的相互作用对bFos-bJun、EGFR-Grb2和STAT5B-STAT5B进行荧光成像,实现了同一活细胞内不同空间定位的三对蛋白质间相互作用的同步光学成像研究。4)利用基于TagRFP和mLumin的红色BiFC系统,实现了线虫体内bFos和bJun相互作用的可视化。37℃下可工作的红色BiFC系统的建立不仅为单对蛋白间相互作用研究提供新选择,而且提供了同时检测多对蛋白质相互作用的可能性。此外,由于远红色荧光蛋白的荧光在组织内散射和被吸收远较其它光谱荧光蛋白少,因此,基于mLumin的BiFC系统更适合于蛋白质-蛋白质相互作用的在体（比如小鼠）研究。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 绪论
• 1.1 蛋白质相互作用简介
• 1.2 蛋白片断互补分析（PCA）
• 1.3 双分子荧光互补技术（BiFC）
• 1.4 BiFC和其它方法的比较
• 1.5 选题背景及本文研究的主要内容
• 2 红色荧光蛋白的BiFC系统
• 2.1 引言
• 2.2 材料与方法
• 2.3 实验结果
• 2.4 讨论
• 2.5 本章小结
• 3 mKate突变体的筛选
• 3.1 引言
• 3.2 材料与方法
• 3.3 实验结果
• 3.4 讨论
• 3.5 本章小结
• 4 基于mLumin的BiFC系统的蛋白相互作用研究
• 4.1 引言
• 4.2 材料与方法
• 4.3 实验结果
• 4.4 讨论
• 4.5 本章小结
• 5 总结与展望
• 致谢
• 参考文献
• 附录 攻读学位期间发表的论文目录