ConA激活的CD4+CD25-T淋巴细胞对NK细胞功能调节的实验研究

论文摘要

哺乳动物的免疫系统可以分为天然免疫和获得性免疫两大类。天然免疫系统作为抵御致病微生物感染的第一道防线在机体防御机制中具有重要意义。获得性免疫作为机体的作为机体的第二道防线进一步发挥强有力的免疫反应。经典免疫学理论认为,遵循正反馈调控,抗原特异性的淋巴细胞将进一步活化天然免疫细胞,共同抵抗致病微生物的入侵。尽管充分的免疫反应是机体抵御致病微生物感染的有力保障,但是免疫细胞的过度活化会造成机体广泛的免疫病理学反应。因此,机体有效的利用各种免疫系统的成员,谨慎的维持着机体免疫反应的微妙平衡,使得机体的免疫反应既能够有效的杀伤致病微生物,又可以避免由于免疫系统过度活化造成的免疫病理的发生。研究表明在天然免疫系统发挥作用时,为了维持机体免疫反应的适中,获得性免疫中的na?ve T细胞（初始T细胞）已经开始调节其作用的发挥,从而使得机体免疫病理降到最低又能最大限度的发挥宿主的防御功能,但对于活化后的获得性免疫系统负向调节天然免疫反应还有待进一步研究。在小鼠到大鼠的异种心脏移植模型中,应用不含T细胞的免疫缺陷裸鼠移植模型时,天然免疫系统的主要效应细胞NK细胞在异种移植物排斥反应中发挥着非常关键的作用,而当采用免疫健全大鼠模型时,虽然移植物中可观察到明显的NK细胞侵润,但是对于异种移植物排斥反应没有显著的影响。提示当获得性免疫细胞T细胞发挥作用时,天然免疫细胞NK的作用可能被抑制,那么其潜在细胞间的联系和机制又是什么呢?NK细胞是天然免疫的重要效应细胞,不需要抗原的预激活,通过细胞毒性和释放细胞因子能够迅速清除机体变异细胞和感染细胞。NK细胞在抗肿瘤和抗感染以及同种异体排斥反应、免疫耐受诱导等方面发挥着重要的作用,因此深入系统的研究NK细胞功能的调节将有助于我们制定更好的增强机体抗感染以及抗肿瘤的免疫治疗策略,同时对于我们充分调动机体有利因素诱导免疫耐受也有着十分重要的意义。NK细胞和获得性免疫系统的T细胞无论从发育、归巢、定位还是功能上都是有着密切的联系。在正常机体内,NK细胞和T细胞能够共同定位于外周淋巴结。在自身免疫性疾病的免疫应答过程中,NK细胞数目的减少和T细胞群体的增殖是同时存在的。这种解剖位置的接近和相对数目的变化都显示T细胞和NK细胞之间存在着直接或者间接的作用关系。作为免疫调节的焦点细胞天然调节性T细胞（CD4+CD25+ T）能够通过其膜表达的TGF-β分子下调NK细胞表面的激活受体NKG2D的表达,从而抑制NK细胞细胞毒性的功能。查阅文献,我们可以清楚的发现除了天然调节性T细胞外,机体外周成熟的CD4+CD25-T细胞经过抗原诱导同样能够抑制其他T细胞和B细胞的免疫应答,例如通过antiCD3、antiCD28以及IL-2联合作用激活的CD4+CD25- T细胞能够以细胞接触的方式抑制其他CD4+ T淋巴细胞的功能,经移植物抗原诱导耐受的CD4+CD25-T细胞能够同nTreg一起抑制皮肤移植物产生的免疫反应,从年老小鼠体内分离的CD4+CD25-T细胞体外抗体活化后能够显现很强的抑制功能等等。而具有调节功能的活化的CD4+CD25- T细胞对于天然免疫细胞如NK细胞的调节却鲜有研究,详细深入的了解激活的T细胞对NK细胞的调节作用能够更全面地了解天然免疫和活化后的获得性免疫系统的关系,搭建两种免疫系统间新的分子和细胞桥梁,揭示机体免疫生理和免疫病理微妙平衡的确切机制,对于充分调动机体“有利”免疫应答因素防治疾病具有重要的理论与实践意义。我们的前期工作发现活化的T细胞能够显著的抑制NK细胞的毒性,而CD4+ T细胞是发挥调节作用的主要T细胞亚群;在清除天然调节T细胞后,激活的CD4+ T细胞群体同样能够有效的抑制NK细胞的毒性。这就提示我们CD4+CD25-T淋巴细胞在活化后能够获得一定的抑制作用,同样发挥着调节天然免疫细胞NK细胞的重要功能。本实验在前期实验的基础上,重点探讨了CD4+CD25-T细胞在被ConA活化后的调节特性,以及这种调节特性对天然免疫细胞NK细胞增殖和毒性以及抗肿瘤功能的影响,并初步探讨了该调节作用潜在的分子机制。我们将本研究获得的主要结果和结论归纳如下:一、CD4+CD25-T淋巴细胞被ConA活化后的调节特性研究:为了充分活化CD4+CD25- T淋巴细胞和避免CD3和CD28抗体Fc段对NK细胞毒性的影响（即Antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity, ADCC）,我们采用ConA作为刺激原来活化T细胞。我们的实验证实CD4+CD25- T淋巴细胞被ConA活化后与其他调节性T细胞一样,能够有效的抑制CD4+ T细胞的功能,但是,ConA活化的CD4+CD25-T淋巴细胞具有自己特有的抑制分子表达特征、调节靶细胞谱以及作用机制等调节特性。1、ConA激活的CD4+CD25- T淋巴细胞能够显著的抑制ConA诱导的CD4+ T细胞的细胞增殖:磁珠分选纯化的CD4+CD25- T细胞被ConA（10μg/ml）活化24h后,应用0.5%多聚甲醛固定活化的细胞,使其不再增殖。应用PBS将多聚甲醛充分洗净,取出固定后的细胞与新鲜分离的CD4+ T细胞在含有ConA的完全培养基中体外共培养72h后,应用3H-TdR掺入实验检测CD4+ T细胞的增殖,结果表明CD4+ T细胞的增殖被显著的抑制,而且由于多聚甲醛固定后的细胞保持完整的细胞膜结构,但不再分泌细胞因子,提示这种抑制作用是细胞接触依赖的。2、定量PCR方法检测ConA激活的CD4+CD25-T细胞的抑制分子的表达:我们的前期实验证实了ConA激活的CD4+CD25-T细胞Foxp3表达为阴性,为了进一步系统的研究其抑制分子的表达,我们检测了经典的抑制分子在该细胞mRNA水平的表达。CTLA-4、GITR、CD39以及CD103分子是nTreg发挥调节功能的主要膜表达分子,IL-10、TGF-β以及穿孔素是nTreg和诱导型调节性T细胞依赖的经典的免疫抑制因子,IL-4是调节性细胞与Tr1细胞区别的标志性分子,因此我们通过定量PCR方法系统检测了这些分子的mRNA在ConA激活的CD4+CD25-T淋巴细胞的表达情况,结果表明与免疫抑制相关的细胞因子的mRNA在CD4+CD25- T淋巴细胞活化后的水平均高于天然调节性T细胞以及na?ve CD4+CD25-T细胞的表达。截然不同的调节因子表达谱提示ConA激活的CD4+CD25-T淋巴细胞与nTreg存在着显著不同,是一类诱导型调节性T细胞。有研究表明ConA能够诱导Tr1细胞的产生,而IL-4的在ConA激活的CD4+CD25-T淋巴细胞的表达表达则说明该群调节性T细胞不同于不产生IL-4的诱导型Tr1细胞。二、ConA激活的CD4+CD25-T淋巴细胞在体外显著抑制IL-2诱导的NK细胞增殖:我们的前期实验证实了ConA激活的CD4+CD25-T淋巴细胞能够显著的抑制NK细胞的细胞毒性。细胞增殖是NK细胞活性的另一个重要的指标,因此,我们测定了具有调节功能的ConA活化的CD4+CD25-T淋巴细胞对于NK细胞增殖的影响。将ConA（10μg/ml）活化的CD4+CD25-T淋巴细胞应用0.5%多聚甲醛固定后,与新鲜分离的NK细胞在IL-2的活化下共培养后24h、48h和72h后,分别应用3H-TdR掺入实验检测NK细胞的增殖,结果表明IL-2诱导的NK细胞的增殖被显著的抑制。NK细胞控制自身增殖和毒性的细胞内外的信号均不相同,而ConA活化的CD4+CD25-T细胞不仅能够有效的抑制NK细胞毒性而且能够抑制NK细胞的增殖,表明该抑制作用是多方面多条途径的。三、激活的CD4+CD25-T淋巴细胞在体内显著抑制NK细胞杀伤肿瘤的功能:NK细胞是杀伤肿瘤细胞的主要效应细胞,因此我们选用了小鼠NK细胞敏感肿瘤细胞黑色素瘤细胞B16,在没有T细胞和B细胞的SCID小鼠体内建立黑色素瘤模型,通过尾静脉输入ConA激活的CD4+CD25-T淋巴细胞至荷瘤小鼠以及抗体清除NK细胞后输入细胞技术,分别检测了NK细胞存在和不含NK细胞情况下,ConA激活的CD4+CD25-T淋巴细胞对于B16肿瘤细胞转移的影响,通过检测肿瘤的生长情况以及荷瘤小鼠的生存时间评价在体内ConA活化的CD4+CD25-T淋巴细胞对于NK细胞杀伤肿瘤细胞的影响,结果表明ConA激活的CD4+CD25-T淋巴细胞能够显著抑制NK细胞杀伤肿瘤的功能,增加了B16肿瘤细胞在小鼠肺部的转移,以及缩短了荷瘤小鼠的生存时间。1、ConA激活的CD4+CD25-T淋巴细胞输入至SCID小鼠中显著增加了B16肿瘤细胞的肺部转移以及缩短了小鼠的生存时间:2×106个ConA激活的CD4+CD25-T淋巴细胞48h内分两次经尾静脉注射至6周龄负载2×105个B16肿瘤细胞的雄性SCID小鼠体内。10天后处死小鼠,检查小鼠肺部肿瘤结节形成情况,结果表明:输入ConA激活的CD4+CD25-T淋巴细胞后,SCID小鼠的肿瘤转移情况不但没有得到更好的控制,反而显著的促进了B16肿瘤细胞的肺部转移。而且转移了活化的CD4+CD25- T淋巴细胞的荷瘤小鼠的生存时间显著短于转移了na?ve CD4+CD25-T淋巴细胞的荷瘤小鼠。2、转移ConA激活的CD4+CD25-T淋巴细胞至抗体清除的荷瘤SCID小鼠对其肿瘤细胞肺部转移的影响消失:将SICD小鼠体内的NK细胞清除后,转移ConA激活的CD4+CD25-T淋巴细胞后,肿瘤的数目无显著变化。提示ConA激活的CD4+CD25-T淋巴细胞能够抑制NK细胞的杀伤毒性,从而促进肿瘤细胞肺部转移。四、激活的CD4+CD25-T淋巴细胞调节NK细胞机制的研究:结果证明,ConA激活的CD4+CD25-T淋巴细胞以细胞接触方式通过其活化后表达的Qa-1分子与NK细胞表面的抑制性受体NKG2A结合通过细胞接触的方式抑制NK细胞的细胞毒性和抗肿瘤的功能。1、ConA激活的CD4+CD25-T淋巴细胞不能够有效的分解ADP为腺苷:应用薄层层析法分析各种调节性T细胞分解ADP为腺苷的能力,结果表明ConA激活的CD4+CD25-T淋巴细胞不能产生有意义水平的腺苷,提示ConA激活的CD4+CD25-T淋巴细胞发挥调节作用为腺苷非依赖的。2、ConA激活的CD4+CD25-T淋巴细胞不直接杀伤NK细胞:将ConA激活的CD4+CD25-T淋巴细胞与CFSE标记的NK细胞共培养24h和48h,PI染色死亡细胞,通过流式细胞检测CFSE阳性细胞的死亡率,判断共培养系统中NK细胞的存活状况。结果显示两种细胞相互培养24h和48h后,共培养系统中的NK细胞的死亡率与对照组无显著的差异,提示我们ConA活化的CD4+CD25-T细胞并不是直接杀伤NK细胞来发挥抑制作用的。3、ConA激活的CD4+CD25-T淋巴细胞通过细胞接触的方式抑制NK细胞的细胞毒性:我们应用0.5%多聚甲醛固定后的ConA激活的CD4+CD25-T淋巴细胞与NK细胞共培养24h和48h,检测NK细胞的细胞杀伤毒性,发现其毒性同样被显著抑制,提示这种抑制作用是与细胞因子无关的细胞接触依赖的。4、Qa-1分子是ConA激活的CD4+CD25-T淋巴细胞发挥抑制功能的关键分子:在体外共培养体系中加入抗Qa-1分子抗体进行抗体阻断实验,结果发现ConA激活的CD4+CD25-T细胞对NK细胞的调节作用被逆转。在体内,我们首先将抗Qa-1分子抗体和ConA激活的CD4+CD25-T淋巴细胞同时经尾静脉注射至SCID小鼠体内,在注射24h、48h和72h后,分离小鼠的脾脏细胞,检测脾脏细胞杀伤NK细胞敏感靶细胞YAC-1的能力,结果表明Qa-1分子的抗体能够有效的逆转ConA激活的CD4+CD25-T淋巴细胞对NK细胞细胞毒性的抑制作用。我们进一步将ConA激活的CD4+CD25-T细胞和抗Qa-1分子抗体同时经尾静脉注射至荷瘤的SCID小鼠,10天后发现B16肿瘤细胞的转移无显著增多,因此体内体外实验均提示该调节作用为Qa-1-NKG2A途径依赖的。总结:一、ConA活化的CD4+CD25-T淋巴细胞具有自己的调节特性:特有的抑制分子表达特征、作用靶细胞谱以及调节作用方式和机制。ConA活化的CD4+CD25- T淋巴细胞表达广泛的抑制分子,能够以细胞接触的方式有效的抑制CD4+ T细胞和NK细胞的功能。二、我们提出了“活化依赖的免疫抑制”假说:综合文献和我们的实验研究结果,我们发现凡是活化的T细胞,均能够在一定程度上获得对一定免疫细胞谱的调节作用,精细地调节自身以及其他免疫细胞的免疫反应强度,这是机体防止免疫系统过度应答和控制免疫内环境稳定的重要机制。三、我们的实验证实CD4+CD25-T淋巴细胞在被ConA活化后具有显著的抑制活性,而这种调节功能能够显著的抑制NK细胞的细胞毒性和增殖,以及NK细胞抑制肿瘤转移的作用,这种调节功能是细胞接触依赖的,通过活化细胞表面表达的MHC-I类分子Qa-1与NK细胞表面的抑制性受体NKG2A结合发挥作用的。四、我们在获得性免疫和天然性免疫系统之间搭建了一座新的桥梁,这对我们深入了解免疫系统的调节和内环境的稳定具有重大意义,将为临床肿瘤生物治疗和烧伤病人感染的防治、烧伤患者免疫功能紊乱的调节以及移植免疫耐受的诱导提供全新的理论基础和研究方向。

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• 4+CD25^- T 淋巴细胞对NK 细胞功能调节的实验研究'>论文正文 ConA 激活的CD⁴+CD25^- T 淋巴细胞对NK 细胞功能调节的实验研究
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• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 全文总结
• 致谢
• 参考文献
• 文献综述 获得性免疫调节天然免疫的研究进展
• 参考文献
• 攻读博士期间发表论文
• 英文论著